Name: detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing
Uploaded: 2013-10-18T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing at JoVE.com

Wir danken Dr. Agnes Viale und die MSKCC Genomics Core-Labor für technische Hilfe. Dieses Protokoll wurde mit Unterstützung der Geoffrey Beene Krebsforschungszentrum und dem Farmer-Familien-Basis entwickelt.

1. DNA und Vorbereitung der Reagenzien Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Aufbereitung und Analyse von 24 Proben (zB 12 Tumor / Normalpaare), kann aber bei kleineren und größeren Chargen angepasst werden. DNA-Proben können von FFPE oder gefrorenem Frischgewebe, zytologischen Proben, oder Blut abzuleiten. Typischerweise werden sowohl Tumor und normalem Gewebe des gleichen Patienten zusammen, um somatische Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden geerbt prof...

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	<li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+oncogene+mutation+profiling+in+human+cancer.">High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer.</a> Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).</li><li>Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+critical+cancer+gene+mutations+in+clinical+tumor+samples.">Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples.</a> PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).</li><li>Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+targeted+mutational+analysis+of+human+tumours:+a+clinical+platform+to+guide+personalized+cancer+medicine.">Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine.</a> EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).</li><li>Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. 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A., Banks, E., Poplin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data.">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).</li><li>Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. 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G., Easton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREST+maps+somatic+structural+variation+in+cancer+genomes+with+base-pair+resolution.">CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution.</a> Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).</li><li>Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+rearrangements+across+cancer+reveal+classes+of+samples+with+distinct+patterns+of+DNA+breakage+and+rearrangement-induced+hypermutability.">Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability.</a> Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Unsere IMPACT-Assay erzeugt eine hohe Rate Ausrichtung, hoch auf-Zielrate, hohe Zielabdeckung und hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Mutationen, indels, und Nummer des Exemplars Veränderungen. Wir haben die Leistungsfähigkeit unserer IMPACT-Assay auf DNA-Sequenz sowohl von frisch gefrorenem nachgewiesen und archiviert FFPE-Proben niedriger DNA-Eingang. Mit der Durchführung ziel Exon-Sequenzierung der wichtigsten Krebs-assoziierte Gene, kann man sehr tief Sequenzabdeckung für die Exons dieser kritischen Gene dadur...

Die Identifizierung der &quot;Fahrer&quot; Tumor genetischen Ereignissen in Schlüssel Onkogene und Tumorsuppressorgene, spielt eine wesentliche Rolle bei der Diagnose und Behandlung vieler Krebsarten 1. Großforschungsanstrengungen massiv parallele Sequenzierung Verwendung &quot;der nächsten Generation&quot; haben die Identifizierung von vielen solcher Krebs-assoziierte Gene, die in den letzten Jahren 2 freigegeben. Allerdings sind diese Sequenzierungsplattformen erfordern in der Regel große Mengen an DNA aus gefrorenem Frischgewebe isoliert und so posiert eine große Einschränkung in der Charakterisierung und Analyse von DNA-Mutationen von konservierten Geweben, wie Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Tumorproben. Verbesserte Bemühungen, effizient und zuverlässig charakterisieren &quot;verwertbare&quot; genomische Informationen aus FFPE Tumorproben die retrospektive Analyse von zuvor überhöhten Proben zu ermöglichen und weiter zu fördern, individuelle Ansätze, um Krebs-Management. Traditionell Molekular diagnostic Labors auf zeitraubende, geringe Durchsatz-Methoden wie die Sanger-Sequenzierung und Echtzeit-PCR für DNA-Mutation Profilierung verlassen. Neuerdings höhere Durchsatzverfahren unter Verwendung von PCR oder Multiplex-Genotypisierung massenspektrometrischen entwickelt worden, um wiederkehrende somatische Mutationen in Schlüsselkrebsgene 3-5 untersuchen. Diese Ansätze sind jedoch dadurch begrenzt, daß nur vorbezeichneten &quot;Hotspot&quot;-Mutationen untersucht, so dass sie zur Detektion inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen ungeeignet. Massiv parallele Sequenzierung bietet mehrere Vorteile gegenüber diesen Strategien, einschließlich der Fähigkeit, ganze Exons für beide gemeinsame und seltene Mutationen zu verhören, die Fähigkeit, weitere Klassen von genomischer Veränderungen, die Kopienzahl Gewinne und Verluste zu offenbaren, und größere Nachweisempfindlichkeit in heterogenen Proben 6, 7 . Gesamtgenom-Sequenzierung stellt den umfassenden Ansatz für die Mutation Entdeckung, obwohl es relativ istly teuer und verursacht großen Rechenaufwand für die Datenanalyse und-speicherung. Für klinische Anwendungen, bei denen nur ein kleiner Anteil des Genoms von klinischem Interesse sein, insbesondere zwei Innovationen in Sequenzierungstechnologie haben transformierende. Erstens, durch Hybridisierung Exon-basierten Erfassung, kann man DNA, die Taste Krebs-assoziierte Gene, die für eine gezielte Mutation Profilierung 8 isolieren. Zweitens, durch Ligation der molekularen Barcodes (dh DNA-Sequenzen 6-8 Nukleotide in der Länge), kann man Hunderte von Proben pro Sequenzierungslauf bündeln und voll die Vorteile der immer größeren Kapazität von massiv-parallele Sequenzierung 10 Instrumente. In Kombination ermöglichen diese Innovationen Tumoren, für niedrigere Kosten profiliert werden und bei höheren Durchsatz, mit kleineren Rechenanforderungen 11. Ferner kann durch die Umverteilung Sequenzabdeckung auf jene Gene am wichtigsten für die bestimmte Anwendung, eine Achie könnenve größer Sequenzierung Tiefe für höhere Nachweisempfindlichkeit für niedrige Allelfrequenz Veranstaltungen. Hier beschreiben wir unsere IMPACT-Assay (Integrated Mutation Profiling von Action Krebs Targets), die Exon-Capture auf einer Barcode-Sequenzbibliothek Pools nutzt durch Hybridisierung unter Verwendung kundenspezifische Oligonukleotide, um alle Protein-kodierenden Exons zu erfassen und wählen Introns von 279 Schlüssel Krebs-assoziierte Gene (Tabelle 1 ). Diese Strategie ermöglicht die Identifikation von Mutationen, indels, Kopienzahl Änderungen, und wählen Sie Strukturänderungen im Zusammenhang mit diesen 279 Gene. Unsere Methode ist mit DNA aus sowohl frisch eingefroren und FFPE Gewebe sowie Feinnadelaspirate und andere Zellproben isoliert kompatibel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Die Bemühungen um die Aufdeckung und Untersuchung von Schlüssel onkogenen Mutationen sind wertvoll, um die geeignete Behandlung für Krebspatienten erleichtern bewährt. Die Errichtung von Hochdurchsatz, massiv parallel sequencing &quot;nächsten Generation&quot; die Entdeckung von vielen solcher Mutationen unterstützt. Um die klinische und translationale Nutzen dieser Technologie zu verbessern, müssen Plattformen mit hohem Durchsatz, kostengünstig und mit Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben, die kleine Mengen von degradierten oder beschädigte DNA ergeben können kompatibel sein. Hier beschreiben wir die Herstellung von Barcode-und Multiplex-DNA-Bibliotheken, gefolgt von der Hybridisierung-basierte Erfassung von Exons für den Nachweis von Krebs-assoziierte Mutationen in frisch eingefroren und FFPE Tumoren durch massiv parallele Sequenzierung. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Sequenzmutationen, die Kopienzahl Änderungen, und wählen strukturelle Umlagerungen gezielte Einbeziehung aller Gene. Gezielte Exon-Sequenzierung bietet ter profitiert von hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung gelegt und somit hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Ein Pool von 24 Bibliotheken mit Barcode-Sequenz (12 Tumor-normal-Paare) wurde mit Sonden, die allen Protein-kodierenden Exons von 279 Krebs-Gene erfasst und sequenziert, wie 2 x 75 bp liest auf einer einzigen Spur einer HiSeq 2000 Durchflusszelle. Tumor-und Normal Bibliotheken wurden in einem Verhältnis von 2:1 vereinigt. Beispiel Performance-Metriken für einen Pool von gefrorenen Tumor DNA-Proben sind in Abbildung 1 dargestellt, einschließlich Ausrichtung Rate Bruchgrößenverteilung, On-Target-Cap...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der &quot;nächsten Generation&quot;. Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Forschung

Biologie

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

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Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear Amplification Mediated PCR ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

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Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

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RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

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Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

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Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...