Name: microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer
Uploaded: 2013-11-02T17:45:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer at JoVE.com

Nous remercions Cécile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard et Bertrand Bonnaud pour leur contribution à l&#39;élaboration initiale et l&#39;optimisation du protocole HERV-V2. Nous tenons également à remercier Hader Haidous pour ses conseils sur des considérations éthiques.

Ce travail a été soutenu par bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon et l&#39;agence publique française OSEO (Avancées Diagnostiques pour de Nouvelles Approches thérapeutiques, un programme financé par le gouvernement français dédié à la médecine personnalisée). PP, VC, GO, NM, et FM sont des employés de bioMérieux SA. PP, NM et FM ont présenté des demandes de brevet couvrant les conclusions de ce document.

Au cours des 10 dernières années, la plupart des tentatives de mesure de l&#39;expression de HERV ont utilisé des techniques de RT-PCR, soit pour se concentrer sur un locus spécifique 20 à 24 ou sur la base de la conservation relative des gènes pol pour évaluer les tendances générales à l&#39;intérieur de HERV genres 25,26 . En outre, les amplifications par PCR en utilisant des amorces dégénérées hautement couplés avec des microréseaux de basse densité destinées à détecter et quantifier l&#39;expression de la famille HERV 27,28. Afin de retracer l&#39;expression de locus individu au sein d&#39;une famille, les approches basées sur l&#39;amplification par PCR de régions conservées combinés avec le clonage et séquençage ultérieur a permis éléments distincts actifs de transcription des HML-2 29,30 ou HERV-E4.1 31 familles à être identifiés. Aussi se terminant par clonage et séquençage des étapes, la technique de contrôle de l&#39;expression de répétition du génome visant à identifier parmi les promoteurs des répétitions identifiées HML-2 LTR solitaire humains spécifiques actives <sup&gt; 32,33. Nous avons développé successivement deux générations de puces à haute densité dédiés à l&#39;analyse du transcriptome de HERV, l&#39;introduction de méthodes appropriées pour répéter la conception de la sonde de l&#39;élément afin de minimiser les réactions croisées entre les éléments paralogues au sein d&#39;une famille 34,35. La puce HERV-V2 qui cible 2690 provirus distinctes et 2883 LTR solo du HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 et HERV-K HML-cinq familles, a dévoilé le expression de HERV loci 1718 (figures 7A et B) dans une large gamme de tissus 35, illustrés dans le présent document par l&#39;identification de biomarqueurs putatifs du cancer de la prostate. En outre, l&#39;utilisation de plusieurs probesets sur un locus donné est informative sur sa régulation transcriptionnelle. Tout d&#39;abord, un signal négatif U3 en conjonction avec un positif d&#39;une classe U5 du LTR en tant que promoteur, et des signaux négatifs inversement U3 et U5 positifs peut refléter un rôle de polyadénylation. Nous avons donc identified 326 LTR promotrices dans une large gamme de tissus 35 et, sur la base de cette U3-U5 informations dichotomique fourni par la matrice, nous avons proposé et confirmé expérimentalement pour certains cas sélectionnés que cette transcription autonome a été contrôlée par un processus épigénétique dépendant de la méthylation 34 (Figure 8). Deuxièmement, la détection de signaux de par exemple LTR, gag et env probesets indépendants ou émis par les sondes ciblant jonction d&#39;épissage spécifique est instructif sur la stratégie d&#39;épissage proviral, comme illustré par le profil d&#39;expression de ERVWE1/Syncytin1 dans le placenta ou dans le testicule tumoral 34. Cela indique que le processus de sélection de la sonde spécifique de HERV est suffisamment robuste pour supporter l&#39;identification d&#39;une stratégie d&#39;épissage tissu associée, aussi efficacement que pour des gènes classiques 36 (figure 8). Cette méthode est la première tentative d&#39;identifier l&#39;expression du locus HERV individuellementen utilisant une puce personnalisée de haute densité basé sur la technologie Affymetrix. Les avantages clairement définis de la forme de puces à ADN pour déchiffrer HERV transcriptome constitué par (i) l&#39;exploration coordonnée de plusieurs familles de HERV et (ii) l&#39;analyse simultanée et indépendante des régions différentes pour chaque locus, par exemple. U3 et U5 domaines pour solo et LTR proviral, régions gag ou env et jonctions possibles épissage associés à des structures provirales, sans a priori sur la fonctionnalité de l&#39;élément de HERV. Perspectives s&#39;appuient sur une amélioration des annotations dans les outils de bioinformatique puces associées. Ceci devrait permettre une pour convertir les signaux de la puce en hypothèses biologiques tels que si HERV actives représentées voiture lncRNA modulent la transcription ou plus ou moins proximale expression du gène codant. En effet, cette hypothèse est étayée par des études récentes qui ont identifié la prostate transcriptions de ncRNA associés au cancer contenant des composants de vORF Iral de la famille HERV-K rétrovirus endogène ou parties d&#39;une région du promoteur LTR viral 37, ainsi que deux événements de fusion de gènes savoir HERV-K22q11-ETV1 et HERV-K17-ETV 38,39. Dans l&#39;ensemble, cette approche globale de la transcriptome combinée avec la fonction LTR et épissage identifications de stratégie peut aider à déchiffrer le marqueur par rapport aux éléments déclencheurs de l&#39;expression des HERV dans chroniques et les maladies infectieuses 40,41 42,43.

Rétrovirus endogènes humains (également appelés HERVs) sont répartis tout au long de notre génome. Ils proviennent d&#39;infections ancestrales et indépendantes au sein de la lignée germinale, suivis par des processus de propagation de copier-coller et menant à des familles à copies multiples. Aujourd&#39;hui, ils ne sont plus infectieux mais ils occupent 8% du génome humain, comme un point de comparaison, les exons couvrent 2% du génome humain. Les données du projet ENCODE publiée en 2012 a montré que les types d&#39;ARN différentes couvrent environ 62% du génome, dont un tiers dans les régions intergéniques. En outre, il apparaît que la quantité de motifs de régulation de transcription est d&#39;au moins 4,5 x plus élevé que celui correspondant aux exons codant pour des protéines. HERV répétitions terminales longues (LTR) représentent une large gamme d&#39;éléments de régulation de transcription potentiels, comme il est habituel dans leur fonction retrovirus infectieux. Historiquement, en dehors de quelques loci exprimé dans le placenta ou des testicules, il était communément admis que HERV sont silencieux du fait de epréglementation igenetic. Par conséquent, nous avons conçu une puce à haute densité, en format Affymetrix, visant à caractériser de manière optimale individu expression HERV loci, afin de mieux comprendre si elles sont actives, s&#39;ils conduisent lncRNA transcription ou modulent l&#39;expression des gènes codant. Cet outil baptisé HERV-V2 intègre GeneChip 23583 probesets HERV et peut discriminer 5573 éléments HERV distinctes composées de LTR solo ainsi que provirus complets et partiels (figure 2). Diagnostic, évaluation et plan: Le diagnostic du cancer de la prostate sont basées sur le dosage de l&#39;antigène spécifique de la prostate (PSA), de biomarqueurs dans les laboratoires cliniques, un examen rectal numérique d&#39;évaluer la modification morphologique de la prostate et, enfin, des biopsies de la prostate observés par le pathologiste. Le manque de spécificité et une sensibilité suffisante entre les marqueurs biologiques du cancer classiques, tels que PSA pour le cancer de la prostate, a été largement reconnu after plusieurs décennies d&#39;implications cliniques 1. Dans un premier temps, le PSA a été proposée pour le diagnostic et le traitement de l&#39;adénocarcinome de la prostate 11. Il était dernier a proposé pour le dépistage du cancer et le suivi de l&#39;évolution de la maladie 12. Cependant, il reste une question qui est régulièrement posée: «Comment utiliser PSA. (I) Une zone grise correspondant à une concentration dans le sérum de 2,5-10 ng / ml ne permet pas une nette différence à faire entre le cancer et non cancéreuse 2, (ii) deux grandes études de cohorte inscrire des centaines de milliers de personnes en Europe et USA n&#39;a pas réussi à venir à une conclusion claire sur l&#39;utilité du dépistage en termes de mortalité spécifique de la maladie 13,14; (iii) l&#39;analyse de PSA paramètres cinétiques post-opératoires telles que la clairance de la PSA, PSA vitesse et le temps de doublement, bien que simple en théorie, peut poser des défis considérables dans l&#39;application pratique de 3,4. On peut s&#39;attendre à ce que dans les prochaines années, l&#39;application de biomarqueurscations soutiendront un choix clinique entre l&#39;attente vigilante et plus ou traitements moins agressifs selon phénotype tumoral. En ce qui concerne le diagnostic rendu par le pathologiste, un premier facteur limitant vient d&#39;un diagnostic de faux négatifs de 20% dans les biopsies de la prostate (de nombreux cancers sont manqués par échantillonnage). Une deuxième préoccupation porte sur la nécessité d&#39;une procédure de biopsie supplémentaire suivant une valeur négative, ce qui peut présenter des effets indésirables. La prostatectomie radicale est actuellement l&#39;un des traitements standard du cancer de la prostate. Il est proposé dans les patients en bonne santé, le vieillissement de 45 à 65 ans, en particulier dans le cas de motifs agressifs (Gleason 7-10), d&#39;une tumeur ou d&#39;une tumeur palpable multifocale. C&#39;est maintenant chose faite dans notre département en utilisant la chirurgie assistée par robot. En raison de l&#39;évidence croissante que les marqueurs moléculaires auront une importance capitale dans les années à venir, nous avons décidé de proposer à tous nos patients la possibilité de participer à un programme pour la prostatebanques de tissus. Plus précisément, les programmes de recherche moléculaire expansion sur le cancer de la prostate ont donné lieu à une demande croissante pour l&#39;accès aux tissus tumoraux frais de haute qualité à partir de pièces de prostatectomie. Cette recherche, en particulier les approches génomiques, nécessaire de larges échantillons de haute qualité de l&#39;ADN / ARN. Tumoraux et les tissus adjacents non-tumoraux »&#39;à partir du même patient sont nécessaires. Recommandations pour la manipulation et le traitement des prostatectomies radicales visent à préserver les caractéristiques pathologiques qui déterminent la scène et le statut des marges et ainsi le potentiel autre traitement et le pronostic. Toute méthode de prélèvement de tissus frais, par conséquent, ne devrait pas compromettre les évaluations pathologiques ultérieures afin d&#39;être acceptable pour le diagnostic. Dissection macroscopique de la prostate est difficile et une grande attention doit être accordée aux tissus de marge et l&#39;invasion capsulaire: une dissection de la prostate bancaire doit toujours être effectuée par un uropathologist formé selon un accordd protocole. Le comité d&#39;éthique de la faculté de médecine et de la commission médicale de l&#39;Etat a accepté de ces enquêtes et le consentement éclairé a été obtenu pour tous les patients inclus dans le tissus de la prostate bancaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Trizol</td>
			<td style="width:92px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15596-026</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNA poly-A control stock</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900433</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DNAse 1</td>
			<td style="width:92px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M6101</td>
			<td style="width:295px;">1,000 U (1 U/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Terminal transferase</td>
			<td style="width:92px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">3333574001</td>
			<td style="width:295px;">400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DLR-1a</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900542</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900454</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">GeneChip Hybridization, Wash and staining</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900720</td>
			<td style="width:295px;">Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">10x One-Phor-All Buffer PLUS</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">74104</td>
			<td style="width:295px;">RNA cleanup protocol</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">WT-Ovation RNA amplification system</td>
			<td style="width:92px;">Nugen</td>
			<td style="width:137px;">2210-24</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">QIAquik PCR purification kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Material Name</td>
			<td style="width:92px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">GS30007G</td>
			<td style="width:295px;">Optional: autoloader</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">FS450</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Hybridization 640 Oven</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">640</td>
			<td style="width:295px;">Includes 4 GeneChip Probe array carriers</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:195px;">Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="232">
			<td height="232" style="height:232px;width:195px;">HERV-V2 chip</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Custom array. 
			For microarray availability (for research use only), please contact: 
			Fran&#231;ois Mallet 
			Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&#233;rieux 
			Medical Diagnostic Discovery Department 
			Centre Hospitalier Lyon Sud, B&#226;timent 3F 
			69495, Pierre B&#233;nite cedex France 
			Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 
			Email: francois.mallet@biomerieux.com</td>
		</tr>
		<tr height="717">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HERV-V2 conception 
			Dedicated database and annotations 
			 
			The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. 
			 
			Locus-specific probes design 
			Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. 
			 
			Custom HERV GeneChip microarray 
			The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer

L&#39;antigène spécifique de la prostate (PSA) est le principal biomarqueur pour le diagnostic du cancer de la prostate dans l&#39;utilisation clinique, mais il manque de spécificité et de sensibilité, en particulier dans les valeurs à faible dosage 1. «Comment utiliser PSA&quot; reste une question d&#39;actualité, que ce soit pour le diagnostic comme une zone grise correspondant à une concentration dans le sérum de 2,5-10 ng / ml, ce qui ne permet pas une différenciation claire soit établie entre le cancer et non cancéreuse 2 ou pour le suivi des patients -comme l&#39;analyse de PSA post-opératoire paramètres cinétiques peuvent poser des défis considérables pour leur application pratique 3,4. Autrement, les ARN non codantes (ARNnc) apparaissent comme des molécules clés dans le cancer humain, avec le potentiel de servir de nouveaux marqueurs de la maladie, par exemple PCA3 pour le cancer de la prostate 5,6 et de révéler des aspects non caractérisées de la biologie de la tumeur. Par ailleurs, les données du projet ENCODE publiée en 2012 a montré que les types d&#39;ARN différentes couvrent environ 62% de la générationome. Il apparaît également que la quantité de motifs de régulation de transcription est d&#39;au moins 4,5 x plus élevé que celui correspondant aux exons codant pour des protéines. Ainsi, les longues répétitions terminales (LTR) de retrovirus endogènes humains (HERV) constituent une vaste gamme de putative / candidats de séquences régulatrices de la transcription, comme il est de leur fonction primaire dans retrovirus infectieux. HERVs, qui sont répartis dans l&#39;ensemble du génome humain, proviennent d&#39;infections ancestrales et indépendantes au sein de la lignée germinale, suivis par des processus de propagation de copier-coller et menant à MultiCopy familles occupant 8% du génome humain (noter que les exons couvrent 2% de notre génome ). Certains loci HERV encore exprimer des protéines qui ont été associés à de nombreuses pathologies, dont le cancer 7-10. Nous avons conçu une puce à haute densité, en format Affymetrix, visant à caractériser de manière optimale individu expression HERV loci, afin de mieux comprendre si elles peuvent être actives, s&#39;ils conduisent ncRNA transcription ou modulate codant l&#39;expression du gène. Cet outil a été appliquée dans le domaine du cancer de la prostate (Figure 1).

La valeur des études transcriptomiques réside principalement dans la qualité du matériel biologique de départ. Si l&#39;extraction de l&#39;ARN est réalisée dans des conditions optimales, le numéro de l&#39;intégrité de l&#39;ARN (RIN) est généralement de 7 ou plus (figure 4A). La nécessité de s&#39;hybrider 2 pg d&#39;ADNc sur la puce Affymetrix HERV-V2 implique l&#39;utilisation d&#39;un processus d&#39;amplification. Une étape d&#39;amplification réussie conduit à une distribution en forme de cloche (figure 4B). Ensuite, fragmentation DNAse1 est effectuée afin d&#39;homogénéiser la distribution de la taille de l&#39;ADNc d&#39;environ 100 nucleotides avant l&#39;hybridation (figure 4C). Après l&#39;hybridation et l&#39;analyse (figure 4D), une inspection visuelle de l&#39;image que l&#39;on permet de vérifier si la grille est bien aligné sur les taches (figure 4E) et si les contrôles d&#39;hybridation sont conformes (figure 4F). Cette étape est également utile dans le but d&#39;exclure des microréseaux dans lesquelles les bulles d&#39;air ou des erreurs<html> produite au cours de l&#39;expérience. Une fois que les puces ont passé QC (Figure 5) et après la normalisation, l&#39;analyse statistique des 5 matches paire tumeur et les échantillons d&#39;ARN normales de la prostate de l&#39;Hôpital Lyon-Sud conduit à l&#39;identification de 207 probesets HERV avec des valeurs d&#39;expression différentielle (p.val &lt;0,05) (Figure 6A). Pour soutenir ces dossiers et d&#39;obtenir des informations spécifiques à la prostate, 35 échantillons match paire supplémentaire (côlon, de l&#39;ovaire, du testicule, du sein, du poumon et de la prostate) ont été ajoutés à l&#39;analyse et la procédure SAM-FDR (FDR = 20%) éventuellement identifié 44 prostate probesets HERV spécifiques. Parmi eux, 10 les structures de HERV les plus pertinentes sont décrites (figure 6B). D&#39;autres études cliniques seront nécessaires pour évaluer les valeurs de la sensibilité et de la spécificité de ces biomarqueurs candidats. pload/50713/50713fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; . Figure 1 le schéma de la procédure globale de la clinique (1: prostatectomie par le clinicien et de la préparation de tissu par le pathologiste) sur le banc (06.02: préparation de l&#39;échantillon, la préparation de la cible, le traitement de puces à ADN) conduisant à l&#39;identification de biomarqueurs candidats (7: analyse bioinformatique des puces à HERV). Acides nucléiques provenant de tissus normaux sont représentés en orange, les acides nucléiques provenant de la zone tumorale sont constitués d&#39;un mélange de la normale (orange) et spécifique de la tumeur (noir) des acides nucléiques. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> . Figure 2 Conception et contenu de la puce HERV-V2: séquences HERVrécupéré à partir du génome humain sont stockées dans une base de données appelée HERV-gDB3, alors les sondes candidates 25-mères passent à travers une procédure de modélisation d&#39;hybridation spécifique (EDA +), avant d&#39;être finalement synthétisé sur la matrice (les sous-régions cibles qui en résultent sont représentées pour chaque famille). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> Figure 3. Manipulation de la prostate par le pathologiste. (A) frais prostatectomie radicale échantillon est transféré au laboratoire. (BC) La prostate est coloré (vert sur ​​le côté droit, noir sur le côté gauche). (D) à grande section transversale de la glande sur le côté postérieur. (E) de laisser les marges intactes, pieces de tissus sont disséqués à partir de différentes zones de la glande de la prostate. (F) Cœurs de tissu sont placés dans un tube Eppendorf. (G) fil de suture est utilisée pour fermer la prostate et d&#39;éviter des distorsions glande et une perturbation minimale de la marge chirurgicale. Ensuite, la prostatectomie radicale échantillon est prêt pour la fixation dans le formol selon la procédure habituelle pour l&#39;analyse histologique. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> Contrôles Figure 4. Qualité de la préparation d&#39;acide nucléique et de l&#39;efficacité d&#39;hybridation. (A) l&#39;intégrité de l&#39;ARN, (B) des cibles ADNc amplifié et (C) la fragmentation des cibles utilisées dans l&#39;étape d&#39;hybridation. ThESE trois contrôles de qualité ont été obtenus avec l&#39;aide de Bioanalyzer ARN puces nano et le dosage eucaryote Nano Série II. (D) l&#39;image globale de la HERV-V2 zone microréseau d&#39;hybridation après la numérisation, (E) l&#39;élargissement de l&#39;angle gauche montrant la grille des contrôles d&#39;alignement supérieur et (F) l&#39;élargissement de la zone centrale montrant repérer les contrôles d&#39;hybridation. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> Figure 5. Traitement des signaux. (A) Affymetrix polyA pic dans les contrôles d&#39;amplification. Le polyA contrôle Dap, Thr, Phe et Lys transcriptions de B. gènes subtilis sont dopés dans l&#39;échantillon d&#39;ARN et servent à évaluer la réussite globale<html> des étapes de préparation de cibles. L&#39;intensité doit être détectée à des valeurs décroissantes entre ces contrôles en pointes pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y avait pas de biais au cours de l&#39;amplification WT-Ovation entre les gènes hautement et faiblement exprimé. (B) Affymetrix pointe dans les contrôles d&#39;hybridation. Ces cibles isolées à partir de E. coli et bactériophage P1 sont dopés avant la procédure de labellisation. Des valeurs croissantes de bioB, bioC, bioD et cre indiquent la réussite globale de l&#39;hybridation. (C) la distribution de l&#39;intensité des signaux de la puce après la normalisation RMA. La plupart des probesets signaux d&#39;exposition avec des valeurs inférieures à 2 6 (arrière-plan), indiquant une expression globale essentiellement restreint à certains HERV loci spécifiques. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figure 6. L&#39;analyse des données. (A) l&#39;analyse de classification hiérarchique des échantillons normaux et tumoraux. regroupement de partitionnement a été appliquée aux valeurs d&#39;expression normalisées en utilisant un algorithme de fonction de la distance euclidienne, regroupant probesets en (rouge) - et vers le bas (bleu)-régulation entre les échantillons normaux et tumoraux. (B) La sélection des 10 meilleurs structures HERV identifiés comme biomarqueur candidat de cancer de la prostate. Pour chaque élément de HERV, la famille HERV connexe, les coordonnées génomiques (NCBI 36/hg18) et une brève description de la structure de HERV sont donnés. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> Figure 7. </strong&gt; Le répertoire de HERV. (A) Le séquençage du génome humain a révélé 25 000 gènes codant pour des protéines (exons, 2%) et une énorme quantité d&#39;éléments transposables, y compris 200 000 à long répétition terminale (LTR) rétrotransposons (HERV, 8%). (B) L&#39;extrapolation de HERV-V2 contenu de la puce et des données d&#39;expression associés (79 échantillons provenant de huit normale par rapport à des types de tissus tumoraux) suggèrent qu&#39;un tiers du répertoire de HERV est transcriptionnellement actif. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> Figure 8. D&#39;interprétation fonctionnelle des signaux de la puce. (A) l&#39;identification du promoteur et le contrôle épigénétique: U3 signal négatif (sonde rouge, 5&#39;LTR) Par rapport à R-U5 signal positif (sonde bleu, 5&#39;LTR) suggèrent entraîné U3-transcription, soutenu par la méthylation CpG différente (cercles noirs solides) du contenu de U3 en peritumoral normale contre les tissus tumoraux. (B) la stratégie de épissure: putatif enveloppe de 3,1 kb codant pour l&#39;ARNm exprimé exclusivement dans la tumeur est identifié à l&#39;aide d&#39;épissage SD1/SA2 jonction chevauchement sonde. * Déduits par la comparaison avec d&#39;autres tissus non-placentaires. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Rétrovirus endogènes humains (HERV), qui occupent 8% du génome humain, conservent les capacités de codage rares mais une centaine de milliers de longues répétitions terminales (LTR). Une coutume Affymetrix microarray a été conçu pour identifier les individus expression du locus HERV et a été utilisé sur les tissus de cancer de la prostate comme une preuve de concept pour de futures études cliniques.

Identification à base de microréseaux de HERV individuelle Loci Expression: Demande de Découverte de biomarqueurs dans le cancer de la prostate

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