Name: microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer
Uploaded: 2013-11-02T17:45:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer at JoVE.com

אנו מודים לססיל Montgiraud, ז&#39;ולייט Gimenez, מגאלי Jaillard ורטרנד בונו על תרומתם לפיתוח ואופטימיזציה הראשוניים של פרוטוקול HERV-V2. כמו כן אנו מבקשים להודות חאדר Haidous להדרכה שלו על שיקולים אתיים.

עבודה זו נתמכה על ידי BIOMERIEUX SA, הוספיס Civils דה ליון וסוכנות הציבור הצרפתי OSEO (מתקדם אבחון לגישות טיפוליות חדש, תכנית במימון ממשלת צרפת המוקדשת לרפואה מותאמת אישית). PP, VC, GO, NM, וFM הם עובדי BIOMERIEUX SA. PP, NM וFM הגישו בקשות לפטנטים המכסות את הממצאים של עבודה זו.

במהלך 10 השנים האחרונות, רוב הניסיונות למדידת ביטוי HERV השתמשו בטכניקות RT-PCR או להתמקד במוקד ספציפי 20-24 או המבוסס על השימור היחסי של גנים pol להעריך מגמות כלליות במסגרת סוגי HERV 25,26 . בנוסף, amplifications PCR באמצעות פריימרים מנוונים ביותר בשילוב עם microarrays צפיפות הנמוך שנועד לזהות ולכמת את הביטוי של משפחות HERV 27,28. על מנת לעקוב אחר הביטוי של לוקוס בודד בתוך משפחה, גישות מבוססות על ההגברה PCR של אזורים שמורים בשילוב עם שיבוט ורצף לאחר מכן אפשר לאלמנטים ברורים תעתיק פעילים של HML-2 29,30 או HERV-E4.1 31 במשפחות להיות מזוהה. כמו כן הסתיים בצעדי שיבוט ורצף, טכניקת ניטור ביטוי החוזרת הגנום במטרה לזהות יזמים בקרב חוזר זיהה HML-2 LTRs הבודד האנושי הספציפי הפעיל <sup&gt; 32,33. אנחנו פיתחנו ברציפות שני דורות של microarrays צפיפות גבוהה מוקדשים לניתוח של transcriptome HERV, החדרת מתודולוגיות מתאימות לעיצוב בדיקה אלמנט חוזר ונשנה במטרה למזער תגובות צולבות בין אלמנטי paralogous בתוך משפחה 34,35. שבב HERV-V2 אשר מטרות 2,690 proviruses מובחן ו2,883 LTRs הסולו של HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 וHML-5 משפחות HERV-K, חשף ביטוי של 1,718 לוקוסי HERV (7 א דמויות ו-B) במגוון רחב של רקמות 35, שמודגמות במאמר זה על ידי זיהוי סמנים לסרטן ערמונית משוערים. בנוסף, השימוש בprobesets מרובה במוקד נתון הוא אינפורמטיבי על תקנת תעתיק שלה. ראשית, איתות שלילית U3 בשיתוף עם חיובי אחד U5 מסווגת LTR כמקדם, ואותות שליליים להפך U3 חיוביים וU5 עשויים לשקף תפקיד polyadenylation. אנחנו ולכן אניdentified 326 LTRs אמרגן במגוון רחב של רקמות 35 ו, המבוססות על מידע זה U3-U5 דיכוטומית המסופק על ידי המערך, שהצענו בניסוי ואשרנו לכמה מקרים נבחרים שהשעתוק אוטונומי כגון נשלט על ידי תהליך מתילציה תלוי אפיגנטיים 34 (איור 8). שנית, הגילוי של אותות מלמשל LTR, איסור הפרסום וprobesets העצמאי env או שהונפק מבדיקות מיקוד צומת אחוי ספציפית הוא אינפורמטיבי על אסטרטגית שחבור proviral, כפי שמודגם בפרופיל ביטוי ERVWE1/Syncytin1 בשליה או באשך tumoral 34. זה מצביע על כך שהתהליך של בחירת בדיקה ספציפית HERV הוא חזק מספיק כדי לתמוך בזיהוי אסטרטגית השחבור הקשורים רקמות, בצורה יעילה ככל לגנים קונבנציונליים 36 (איור 8). שיטה זו היא הניסיון הראשון לזהות ביטוי מוקד בנפרד HERVבאמצעות microarray צפיפות גבוה מותאם אישית המבוסס על טכנולוגיה של Affymetrix. היתרונות זוהו בבירור של פורמט microarray לפענח transcriptome HERV בהיקף של (i) החיפושים מתואמים של כמה משפחות HERV וכן (ii) הניתוח סימולטני ועצמאי של האזורים השונים עבור כל מוקד, למשל. תחומים U3 וU5 לסולו וLTRs proviral, אזורי איסור פרסום או env וצמתים אפשריים שחבור הקשורים למבני proviral, ללא כל פריורי על הפונקציונליות של אלמנט HERV. סיכויים להסתמך על שיפור של הסברים בכלי biocomputing הקשורים microarray. זה אמור לאפשר אחד כדי להמיר אותות שבב להשערות ביולוגיות כגון האם HERVs הפעיל מעיד לנהוג שעתוק lncRNA או לווסת פחות או יותר הפרוקסימלי ביטוי גני קידוד. ואכן, הנחה זו נתמכת על ידי מחקרים שנעשה לאחרונה כי זיהו תמלילי ncRNA ערמונית סרטן קשור המכילים רכיבים של vORFs iral ממשפחת HERV-K אנדוגני רטרווירוס או החלקים של אזור המקדם LTR נגיפי 37, וכן שני אירועי היתוך גן כלומר HERV-K22q11-ETV1 וHERV-K17-ETV 38,39. יחדיו, גישת transcriptome כל זה בשילוב עם פונקצית LTR והזדהויות אסטרטגית שחבור עשויה לעזור לפענח את הסמן מול רכיבי הדק ביטוי HERV ב40,41 כרוניים ומחלות זיהומיות 42,43.

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (המכונים גם HERVs) פזורים בכל רחבי הגנום שלנו. הם נובעים מזיהומים אבות ועצמאיים בתוך הקו נבט, ואחרי תהליכי התפשטות העתקה והדבקה ומובילים למשפחות multicopy. היום, הם לא מדבקים יותר, אך הם תופסים 8% של הגנום האנושי; כנקודת השוואה, אקסונים span 2% של הגנום האנושי. נתונים מפרויקט ENCODE פורסם ב2012 הראו כי סוגים שונים RNA לכסות על 62% של הגנום, ובכלל זה שליש באזורי intergenic. יתר על כן, נראה כי הסכום של מוטיבים רגולטוריים תעתיק הוא גבוה יותר לפחות 4.5x מזו מקבילה לאקסונים המקודדים חלבונים. חוזר HERVs ארוך מסוף (LTR) מייצג מגוון רחב של אלמנטים רגולטוריים תעתיק פוטנציאליים, כפי שהוא הפונקציה הרגילה שלהם ברטרווירוסים זיהומיות. מבחינה היסטורית, חוץ מכמה לוקוסים הביעו בשליה או האשך, זה היה שסבר שHERV שותק בשל epהרגולציה igenetic. לכן, יש לנו תוכננו microarray בצפיפות גבוהה, בפורמט Affymetrix, במטרה לאפיין בצורה אופטימלית ביטוי לוקוסי HERV בודד, על מנת להבין טוב יותר אם הם פעילים, אם הם נוסעים שעתוק lncRNA או לווסת את קידוד ביטוי גנים. כלי זה מכונה HERV-V2 GeneChip משלב 23,583 probesets HERV ויכול להפלות 5,573 אלמנטים ברורים HERV המורכב מLTRs סולו, כמו גם proviruses מלא וחלקי (איור 2). אבחון, הערכה, ותכנית: אבחנה של סרטן הערמונית מבוססת על מינון של אנטיגן ספציפי לערמונית סמן (PSA) במעבדה קלינית, בדיקה רקטלית דיגיטלית להעריך שינוי מורפולוגי של הערמונית ובסופו ביופסיות ערמונית שנצפו על ידי פתולוג. היעדר ספציפי מספיקים ורגישות בין סמנים לסרטן קונבנציונליים, כגון PSA לסרטן הערמונית, הוכר af נרחבter כמה עשורים של השלכות קליניות 1. בתחילה, ה-PSA הוצעה לאבחון וטיפול באדנוקרצינומה של הערמונית 11. זה היה אחרון שהוצע לבדיקות סקר לסרטן ולמעקב אחר התפתחות המחלה 12. עם זאת, נותרת שאלה שנשאלת באופן קבוע: &quot;איך להשתמש PSA &#39;. (I) אזור אפור המתאים לריכוז בסרום של בין 2.5-10 ng / ml אינו מאפשר הבדל ברור שיש להבחין בין הסרטן וnoncancer 2 (ii) שני מחקרי עוקבה גדולים להירשם מאות אלפי אנשים באירופה וב ארה&quot;ב לא הצליחה להגיע למסקנה ברורה לגבי התועלת של הקרנה במונחים של תמותה ספציפית למחל 13,14; ניתוח (iii) של פרמטרים ה-PSA לאחר ניתוח הקינטית כגון אישור ה-PSA, מהירות PSA וזמן הכפלה, אם כי פשוטה בתאוריה, יכול להוות אתגר משמעותי ב3,4 יישום המעשי. אנו עשויים לצפות כי בשנים הקרובות, אפליקציה סמן ביולוגיlications יתמוך בחירה קלינית בין מחכה פקוחה ויותר או טיפולים פחות אגרסיביים בהתאם לפנוטיפ גידול. בנוגע לאבחנה שניתנו על ידי פתולוג, גורם מגביל ראשון מגיע מ20% אבחון שלילי שגוי בביופסיות ערמונית (סרטן רבים הם החמיצו על ידי דגימה). חשש שני עוסק בצורך בהליך ביופסיה נוסף הבאים שלילי, אשר עשוי להציג תופעות לוואי. כריתה רדיקאלית של ערמונית היא כיום אחד הטיפולים סטנדרטיים בסרטן הערמונית. מוצע בחולים בריאים, הזדקנות 45-65 שנים, במיוחד במקרה של דפוסים אגרסיביים (7 גליסון ל10), גידול multifocal או גידול מוחשי. עכשיו זה נעשה במחלקה שלנו באמצעות ניתוח סייע רובוטית. בגלל הראיות הולכות ומצטברים כי סמנים מולקולריים יהיו חשיבות עליונה בשנים הקרובות, מצאנו לנכון להציע לכל המטופלים שלנו את האפשרות של השתתפות בתכנית לערמוניתבנקאות רקמות. לייתר דיוק, תוכניות מחקר מולקולרי הרחבת על סרטן הערמונית גרמו לדרישה הולכת וגוברת לגישה לרקמות גידול טריות באיכות גבוהה מדגימות כריתת ערמונית. מחקר זה, בפרט גישות גנומי, נדרשות דגימות גדולות באיכות הגבוהה DNA / RNA. Tumoral ורקמות סמוכות &#39;tumoral שאינו&#39; מאותו החולה יש צורך. המלצות לטיפול ועיבוד prostatectomies הרדיקלי נועדו לשמר את התכונות פתולוגיים הקובעות במה ומעמדה שולי וטיפול נוסף ובכך הפוטנציאל והפרוגנוזה. כל שיטת דגימת רקמה טרי, ולכן, לא צריכה להתפשר הערכות פתולוגי שלאחר מכן כדי להיות מקובל על האבחנה. נתיחה מקרוסקופית של הערמונית היא קשה ותשומת לב רבה צריכה להיות משולמת לרקמות שולי ופלישה קופסית: נתיחה בשום צורה לבנקאות ערמונית צריכה להתנהל תמיד מאומן uropathologist לפי מסכיםפרוטוקול ד. ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה והעדה הרפואית הסכימה המדינה לחקירות אלה והסכמה מהדעת שהתקבלה עבור כל החולים שנכללו בבנקאות רקמות ערמונית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Trizol</td>
			<td style="width:92px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15596-026</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNA poly-A control stock</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900433</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DNAse 1</td>
			<td style="width:92px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M6101</td>
			<td style="width:295px;">1,000 U (1 U/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Terminal transferase</td>
			<td style="width:92px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">3333574001</td>
			<td style="width:295px;">400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DLR-1a</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900542</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900454</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">GeneChip Hybridization, Wash and staining</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900720</td>
			<td style="width:295px;">Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">10x One-Phor-All Buffer PLUS</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">74104</td>
			<td style="width:295px;">RNA cleanup protocol</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">WT-Ovation RNA amplification system</td>
			<td style="width:92px;">Nugen</td>
			<td style="width:137px;">2210-24</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">QIAquik PCR purification kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Material Name</td>
			<td style="width:92px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">GS30007G</td>
			<td style="width:295px;">Optional: autoloader</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">FS450</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Hybridization 640 Oven</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">640</td>
			<td style="width:295px;">Includes 4 GeneChip Probe array carriers</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:195px;">Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="232">
			<td height="232" style="height:232px;width:195px;">HERV-V2 chip</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Custom array. 
			For microarray availability (for research use only), please contact: 
			Fran&#231;ois Mallet 
			Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&#233;rieux 
			Medical Diagnostic Discovery Department 
			Centre Hospitalier Lyon Sud, B&#226;timent 3F 
			69495, Pierre B&#233;nite cedex France 
			Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 
			Email: francois.mallet@biomerieux.com</td>
		</tr>
		<tr height="717">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HERV-V2 conception 
			Dedicated database and annotations 
			 
			The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. 
			 
			Locus-specific probes design 
			Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. 
			 
			Custom HERV GeneChip microarray 
			The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer

אנטיגן ספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לאבחון העיקרי לסרטן הערמונית בשימוש קליני, אבל היא חסרה ייחוד ורגישות, בעיקר בערכי מינון נמוכים 1. &#39;כיצד להשתמש PSA&#39; נשאר גיליון הנוכחי, או לאבחון כמו אזור אפור המתאים לריכוז בסרום של בין 2.5-10 ng / ml שאינו מאפשר הבחנה ברורה שיש להבחין בין הסרטן וnoncancer 2 או למעקב מטופל למעלה כניתוח של ה-PSA לאחר ניתוח פרמטרים הקינטית יכולים להוות אתגר לא מבוטל ליישום המעשי שלהם 3,4. לחלופין, RNAs noncoding (ncRNAs) הם מתעוררים כמו מולקולות מפתח בסרטן בבני אדם, עם הפוטנציאל לשמש כסמני רומן של מחלה, למשל PCA3 בסרטן ערמונית 5,6 וכדי לחשוף היבטי uncharacterized של ביולוגיה של גידול. יתר על כן, הנתונים מפרויקט ENCODE שפורסם בשנת 2012 הראו כי סוגים שונים RNA לכסות על 62% מgenשת. כמו כן, נראה כי הסכום של מוטיבים רגולטוריים תעתיק הוא גבוה יותר לפחות 4.5x מזו מקבילה לאקסונים המקודדים חלבונים. לפיכך, חזרות ארוכות מסוף (LTRs) של רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERVs) מהוות מגוון רחב של רצפים רגולטוריים תעתיק משוער / מועמד, כפי שהיא הפונקציה העיקרית שלהם ברטרווירוסים זיהומיות. HERVs, אשר פזורות בכל רחבי הגנום האנושי, מקורן בזיהומי אבות ועצמאיים בתוך הקו נבט, ואחרי תהליכי התפשטות העתקה והדבקה ומובילים לmulticopy משפחות הכובשים 8% של הגנום האנושי (שימו לב שאקסונים span 2% של הגנום שלנו ). לוקוסי HERV חלקם עדיין לבטא חלבונים שנקשרו עם מספר פתולוגיות כוללים הסרטן 7-10. יש לנו תוכנן microarray בצפיפות גבוהה, בפורמט Affymetrix, במטרה לאפיין בצורה אופטימלית ביטוי לוקוסי HERV בודד, על מנת להבין טוב יותר אם הם יכולים להיות פעילים, אם הם נוסעים שעתוק ncRNA או מ &#39;odulate קידוד ביטוי גנים. כלי זה כבר מיושם בתחום סרטן הערמונית (איור 1).

הערך של לימודי transcriptomic נעוץ בעיקר באיכות של החומר ביולוגי שמתחיל. אם מיצוי RNA מתבצע בתנאים אופטימליים, RNA היושרה מספר (רין) הוא בדרך כלל (איור 4 א) 7 ומעלה. הצורך להכליא 2 מיקרוגרם של cDNA על שבב Affymetrix HERV-V2 מרמז על השימוש בתהליך הגברה. צעד הגברה מוצלח מוביל להפצה דמוית פעמון (איור 4). לאחר מכן, פיצול DNAse1 מבוצע כדי homogenize התפלגות גודל cDNA סביב 100 נוקלאוטידים לפני ההכלאה (איור 4C). לאחר הכלאה וסריקה (איור 4D), בדיקה ויזואלית של התמונה מאפשרת אחד כדי לבדוק אם הרשת מיושרת היטב לכתמים (איור 4E) ואם בקרות הכלאה עולות בקנה אחד (איור 4F). צעד זה שימושי גם כדי להוציא microarrays בי בועות אוויר או טעויות<html> התרחש במהלך הניסוי. ברגע שהשבבים עברו QC (איור 5) ולאחר נורמליזציה, הניתוח הסטטיסטי של 5 גידול ההתאמה זוג ודגימות RNA ערמונית נורמליות מבית החולים בליון-Sud הוביל לזיהוי של 207 probesets HERV עם ערכי ביטוי ההפרש (p.val &lt;0.05) (איור 6 א). כדי לתמוך בעדויות אלו וכדי לקבל מידע ספציפי לערמונית, 35 דגימות נוספות התאמה זוג (מעי גס, השחלה, אשכים, שד, ריאות וערמונית) נוספו לניתוח והליך SAM-FDR (FDR = 20%) זיהה סופו של דבר 44 probesets HERV ספציפי לערמונית. ביניהם, את מבני HERV הרלוונטיים ביותר 10 מתוארים (איור 6). מחקרים קליניים נוספים יידרשו על מנת להעריך את הערכים של רגישות וספציפיות של סמנים ביולוגיים מועמד אלה. pload/50713/50713fig1.jpg &quot;width =&quot; &quot;/&gt; 500px . איור 1 ערכה של הליך הכולל מהמרפאה (1: כריתת ערמונית על ידי המטפל והכנת הרקמה על ידי פתולוג) לספסל (2-6: הכנת מדגם, הכנת היעד, עיבוד microarray) מובילה לזיהוי סמנים ביולוגיים מועמד (7: ניתוח biocomputing של microarrays HERV). חומצות גרעין הנגזרות מהרקמה נורמלית מתוארות בכתום; חומצות גרעין הנגזרות מאזור tumoral מורכבת מתערובת של רגיל (כתום) וספציפי של גידול (שחורה) חומצות גרעין. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> . איור 2 התעברות ותוכן של שבב HERV-V2: רצפי HERVמאוחזר מהגנום האנושי מאוחסנים במסד נתונים בשם HERV-gDB3, ולאחר מכן בדיקות מועמד 25-mer לעבור הליך דוגמנות הכלאה ייעודי (EDA +) לפני שמסונתזים סופו של דבר במערך (תת האזורים הממוקדים וכתוצאה מכך מתוארים עבור כל משפחה). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. טיפול ערמונית על ידי פתולוג. () דגימת כריתה רדיקאלית של ערמונית טריות מועבר למעבדה. (BC) הערמונית מוכתמת (ירוק בצד ימין, שחור בצד השמאל). (ד) סעיף רוחבי גדול של הבלוטה בצד האחורי. (ה) השארת השוליים שלם, pieces של רקמות הם גזורים מאזורים השונים של בלוטת הערמונית. (F) ליבות של רקמה ממוקמות בצינור Eppendorf. (ז) חוט תפר משמש כדי לסגור את הערמונית וכדי למנוע עיוות בלוטה והפרעה מזערית של השוליים הניתוחיים. ואז, את דגימת הכריתה רדיקאלית של הערמונית היא מוכנה לתיקון בפורמלין על פי הנוהל המקובל לניתוח היסטולוגית. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> פקדי איור 4. איכות של הכנת חומצות גרעין ויעילות הכלאה. () CDNA שלמות RNA, (ב &#39;) מוגבר מטרות ויעדים (C) מקוטעים המשמשים בשלב ההכלאה. הESE שלוש בקרות איכות התקבלו עם Bioanalyzer באמצעות שבבי ננו RNA וassay eukaryote ננו Serie השני. (ד) תמונה כוללת של אזור HERV-V2 הכלאה microarray לאחר סריקה, (E) הגדלה של בקרות הפינה השמאלית העליונות מציג רשת היישור וגדלה (F) באזור המרכז מראה איתור פקדי הכלאה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> איור 5. עיבוד האותות. () Affymetrix הפולה ספייק-בבקרת הגברה. הפולה שולט תמלילי DAP, Thr, Phe ויס מB. גנים subtilis הם זינקו במדגם RNA וישמשו על מנת להעריך את ההצלחה הכוללת<html> משלבי הכנת היעד. עוצמה צריכה להיות מזוהה בהפחתת ערכים בין פקדי ספייק-באלה כדי להבטיח שלא הייתה הטיה בהגברת WT-Ovation בין הפערים והגנים הביעו נמוכים. (ב) Affymetrix ספייק-בבקרת הכלאה. יעדים אלה בודדו מE. coli וbacteriophage P1 הם זינקו לפני הליך התיוג. ערכים גובר מצד BioB, BioC, BioD וCre מצביעים על ההצלחה הכוללת של ההכלאה. (ג) חלוקת עוצמת אותות השבב לאחר הנורמליזציה RMA. רוב אותות תערוכת probesets עם ערכים נמוכים מ -2 6 (רקע), המציין ביטוי כולל בעיקר מוגבל לכמה לוקוסי HERV ספציפיים. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> &quot;Width =&quot; ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;/&gt; 500px איור 6. ניתוח נתונים. (א) ניתוח אשכולות היררכי של דגימות נורמליות וtumoral. אשכולות מחיצות היו מוחלים על ערכי ביטוי המנורמל באמצעות אלגוריתם פונקצית מרחק אוקלידי, קיבוץ probesets לעד (אדום) - ולמטה (כחולה) תקנה בין דגימות נורמליות וtumoral. בחירה (ב) למבני HERV העליונים 10 זוהו כסמן ביולוגי מועמד של סרטן הערמונית. עבור כל רכיב HERV, משפחת HERV קשורה, הקואורדינטות גנומית (צמח השדה 36/hg18) ותיאור קצר של מבנה HERV מקבלים. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> איור 7. </strong&gt; רפרטואר HERV. () רצף של הגנום האנושי חשף 25,000 גנים המקודדים חלבונים (אקסונים, 2%) וכמות עצומה של אלמנטי transposable כולל 200,000 חוזר ארוך מסוף (LTR) retrotransposons (HERV, 8%). אקסטרפולציה (ב &#39;) מתוכן שבב HERV-V2 ונתונים הביטוי משויך (79 דגימות שמקורן 8 רגילים לעומת סוגי tumoral רקמות) מצביעים על כך ששליש מרפרטואר HERV הוא תעתיק פעיל. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> איור 8. פרשנות פונקציונלית של אותות מהשבב. (א) זיהוי יזם ושליטה אפיגנטיים: איתות שלילית U3 (חללית אדומה, 5&#39;LTR) לעומת איתות חיובית R-U5 (חללית כחולה, 5&#39;LTR) מציע שעתוק מונע U3, נתמך על ידי מתילציה השונות CPG (עיגולים שחורים מוצקים) התוכן של U3 בperitumoral הנורמלי לעומת רקמות tumoral. אסטרטגית שחבור (ב &#39;): מעטפת 3.1 kb המשוער קידוד ה-mRNA ביטוי אך ורק בגידול מזוהה באמצעות צומת אחוי SD1/SA2 חופף בדיקה. * להסיק מההשוואה עם רקמות שאינן שליה אחרות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer at JoVE.com

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERV), אשר תופסים 8% של הגנום האנושי, לשמור על יכולות קידוד נדירות אבל מאה אלף חזרות ארוכות מסוף (LTRs). Microarray Affymetrix מותאם אישית תוכנן כדי לזהות ביטוי לוקוס HERV הבודד והיה בשימוש ברקמות סרטן ערמונית כהוכחה של מושג למחקרים קליניים בעתיד.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

הטמעה מדויקת של מינון מינימלי של אריתמה (מד) בדיקות להערכת וריאציה אינדיבידואלית בתגובה דלקתית אנושית

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...