Name: microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer
Uploaded: 2013-11-02T17:45:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer at JoVE.com

Agradecemos Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard y Bertrand Bonnaud por su contribución al desarrollo inicial y la optimización del protocolo HERV-V2. También queremos dar las gracias a Hader Haidous por su orientación sobre consideraciones éticas.

Este trabajo fue apoyado por bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon y la agencia pública francesa OSEO (Diagnóstico avanzado de enfoques en Nueva terapéuticas, un programa financiado por el gobierno francés dedicado a la medicina personalizada). PP, VC, GO, NM, y FM son empleados de bioMérieux SA. PP, NM y FM han presentado solicitudes de patente de las conclusiones de este trabajo.

Durante los últimos 10 años, la mayor parte de los intentos para la medición de la expresión de HERV se han utilizado técnicas de RT-PCR, ya sea para centrarse en un locus específico 20-24 o basado en la conservación relativa de los genes pol para evaluar las tendencias generales dentro de HERV géneros 25,26 . Además, las amplificaciones de PCR usando cebadores altamente degenerados junto con microarrays de baja densidad destinados a detectar y cuantificar la expresión de las familias HERV 27,28. Con el fin de rastrear la expresión de locus individual dentro de una familia, los enfoques basados ​​en la amplificación por PCR de regiones conservadas en combinación con la posterior clonación y secuenciación habilitar distintos elementos transcripcionalmente activos de los HML-2 29,30 o HERV-E4.1 31 familias a ser identificado. También termina por etapas de clonación y secuenciación, la técnica de monitorización expresión repetida del genoma con el objetivo de identificar a los promotores entre repeticiones identificados activos HML-2 LTR solitarios humanos específicos <sup&gt; 32,33. Hemos desarrollado sucesivamente dos generaciones de micromatrices de alta densidad dedicados al análisis del transcriptoma de HERV, la introducción de metodologías adecuadas para el diseño de la sonda elemento que se repite con el fin de minimizar las reacciones cruzadas entre los elementos parálogos dentro de una familia 34,35. El chip HERV-V2 que se enfoca en 2690 provirus distintas y 2883 LTR en solitario de los HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 y HERV-K HML-5 familias, dio a conocer el expresión de 1718 HERV loci (Figuras 7A y B) en una amplia gama de tejidos 35, ilustrados en este documento por la identificación de biomarcadores putativos de cáncer de próstata. Además, el uso de múltiples probesets en un locus dado es informativo acerca de su regulación transcripcional. En primer lugar, una señal negativa U3 en conjunción con uno positivo U5 clasifica la LTR como un promotor, y señales negativas a la inversa U3 y U5 positivos puede reflejar un papel de poliadenilación. Así, identified 326 promotor LTR en una amplia gama de tejidos 35 y, basándose en esta información dicotómica U3-U5 proporcionada por la matriz, propusimos y experimentalmente confirmada para algunos casos seleccionados que dicha transcripción autónoma fue controlada por un proceso epigenético de metilación dependientes 34 (Figura 8). En segundo lugar, la detección de señales de, por ejemplo LTR, gag y env probesets independientes o emitidos desde las sondas dirigidas a empalme específica es informativo acerca de la estrategia de empalme proviral, como lo ilustra el perfil de expresión ERVWE1/Syncytin1 en la placenta o en el testículo tumoral 34. Esto indica que el proceso de selección de la sonda específica de HERV es lo suficientemente robusta como para soportar la identificación de la estrategia de corte y empalme asociado de tejido, la manera más eficiente para los genes convencionales 36 (Figura 8). Este método es el primer intento de identificar la expresión locus HERV de forma individualutilizando un microarray personalizada de alta densidad basada en la tecnología de Affymetrix. Las ventajas claramente identificados de la formato de micromatriz para descifrar transcriptoma HERV consiste en (i) la exploración coordinada de varias familias HERV y (ii) el análisis simultáneo e independiente de las diferentes regiones para cada locus, por ejemplo. U3 y U5 dominios para solista y LTR proviral, regiones gag o env y posibles uniones empalmadas asociados con estructuras proviral, sin ningún a priori sobre la funcionalidad del elemento HERV. Las perspectivas se basan en una mejora de las anotaciones de las herramientas bioinformáticas microarrays asociada. Esto debería permitir a uno para convertir las señales de chips en hipótesis biológicas tales como si HERVs activos evidenciados en coche lncRNA transcripción o modulan más o menos proximal codificación de la expresión génica. De hecho, tal hipótesis está apoyada por estudios recientes que identificaron próstata transcripciones ncRNA casos de cáncer asociados con componentes de vORFs víricas de la familia HERV-K endógena retrovirus o porciones de una región promotor LTR viral 37, así como dos eventos de fusión de genes a saber HERV-K22q11-Etv1 y HERV-K17-ETV 38,39. En su conjunto, este enfoque transcriptoma todo combinado con la función de LTR y las identificaciones de estrategia de empalme puede ayudar a descifrar el marcador frente a los componentes de activación de la expresión HERV en crónica y las enfermedades infecciosas 40,41 42,43.

Retrovirus endógenos humanos (también llamados HERVs) se extienden por todo nuestro genoma. Se originan en infecciones ancestrales e independientes dentro de la línea germinal, seguidos de procesos de propagación de copiar y pegar, y que llevan a las familias de múltiples copias. Hoy en día, que no son más infecciosa pero que ocupan 8% del genoma humano; como un punto de comparación, los exones abarcan 2% del genoma humano. Los datos del proyecto ENCODE publicados en 2012 mostraron que los diferentes tipos de ARN cubren alrededor del 62% del genoma, incluyendo un tercio de las regiones intergénicas. Por otra parte, parece que la cantidad de motivos reguladores de la transcripción es al menos 4,5 veces más alto que el correspondiente a los exones codificantes de proteínas. HERV repeticiones terminales largas (LTR) representan una amplia gama de potenciales elementos reguladores de la transcripción, ya que es su función habitual en los retrovirus infecciosos. Históricamente, aparte de unos pocos loci expresado en la placenta o los testículos, se cree comúnmente que HERV son silenciosa debido a EPregulación igenetic. Por lo tanto, hemos diseñado un microarray de alta densidad, en formato de Affymetrix, con el objetivo de caracterizar de manera óptima expresión loci HERV individual, con el fin de entender mejor si están activas, si conducen transcripción lncRNA o modulan la expresión de genes de codificación. Esta herramienta apodada HERV-V2 GeneChip integra 23583 probesets HERV y puede discriminar 5.573 elementos HERV distintas compuestas de LTR en solitario, así como provirus completos y parciales (Figura 2). Diagnóstico, Evaluación y Plan: El diagnóstico de cáncer de próstata se basa en la dosis del antígeno específico de la próstata (PSA) biomarcador en el laboratorio clínico, un examen rectal digital para evaluar la alteración morfológica de la próstata y, finalmente, las biopsias de próstata observadas por el patólogo. La falta de especificidad y la sensibilidad suficiente entre biomarcadores de cáncer convencionales, tales como PSA para el cáncer de próstata, ha sido ampliamente reconocido AFter varias décadas de implicaciones clínicas 1. Inicialmente, el PSA se propuso para el diagnóstico y el tratamiento de adenocarcinoma de la próstata 11. Era esta última propuesto para la detección del cáncer y seguimiento de la evolución de la enfermedad 12. Sin embargo, sigue habiendo una pregunta que se hace con regularidad: &#39;cómo utilizar PSA&#39;. (I) Una zona gris correspondiente a una concentración en suero de 2,5 a 10 ng / ml no permite una clara diferencia que se hace entre el cáncer y no cáncer 2, (ii) dos estudios de cohortes grandes inscribir a cientos de miles de personas en Europa y EE.UU. no pudo llegar a una conclusión clara sobre la utilidad del cribado en cuanto a la mortalidad específica de la enfermedad 13,14, (iii) el análisis de los parámetros cinéticos del PSA después de la operación como el despacho de PSA, velocidad de PSA y el tiempo de duplicación, aunque simple en teoría, puede plantear considerables retos en 3,4 la aplicación práctica. Podemos esperar que en los próximos años, la aplicación de biomarcadorescaciones apoyarán una opción clínica entre la espera vigilante y más o tratamientos menos agresivos dependiendo de fenotipo tumoral. En relación con el diagnóstico emitido por el patólogo, un primer factor de limitación proviene de un diagnóstico de falsos negativos del 20% dentro de las biopsias de próstata (muchos tipos de cáncer se pierden por muestreo). Una segunda preocupación tiene que ver con la necesidad de un procedimiento de biopsia adicional después de una negativa, que pueden presentar efectos adversos. La prostatectomía radical es en la actualidad uno de los tratamientos estándar para el cáncer de próstata. Se propone en pacientes sanos, envejecimiento de 45 a 65 años, especialmente en el caso de patrones agresivos (Gleason 7 a 10), tumor multifocal o tumor palpable. En la actualidad se realiza en nuestro departamento mediante cirugía asistida por robot. Debido a la creciente evidencia de que los marcadores moleculares tendrán suma importancia en los próximos años, se decidió proponer a todos nuestros pacientes la posibilidad de participar en un programa para la próstatabancos de tejidos. Más precisamente, los programas de investigación en expansión moleculares en el cáncer de próstata se han traducido en una creciente necesidad de acceso a los tejidos de alta calidad tumorales frescas de las piezas de prostatectomía. Esta investigación, en particular los enfoques genómicos, requiere grandes muestras de alta calidad de ADN / ARN. Tumoral y tejidos adyacentes &#39;no&#39; tumorales del mismo paciente se necesitan. Recomendaciones para el manejo y procesamiento de prostatectomías radicales están diseñados para preservar las características patológicas que determinan el escenario y estado de los márgenes y por lo tanto el potencial más tratamiento y el pronóstico. Cualquier método de muestreo de tejido fresco, por lo tanto, no debe comprometer evaluaciones patológicas posteriores con el fin de ser aceptable para el diagnóstico. Disección macroscópica de la próstata es difícil y requiere gran atención debe prestarse a los tejidos de margen y la invasión capsular: ninguna disección para la banca de próstata debe ser siempre realizada por un uropathologist entrenados de acuerdo a un acuerdod protocolo. El comité de ética de la Facultad de Medicina y de la junta médica del estado de acuerdo a estas investigaciones y el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes incluidos en la banca tejidos de la próstata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Trizol</td>
			<td style="width:92px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15596-026</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNA poly-A control stock</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900433</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DNAse 1</td>
			<td style="width:92px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M6101</td>
			<td style="width:295px;">1,000 U (1 U/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Terminal transferase</td>
			<td style="width:92px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">3333574001</td>
			<td style="width:295px;">400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DLR-1a</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900542</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900454</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">GeneChip Hybridization, Wash and staining</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900720</td>
			<td style="width:295px;">Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">10x One-Phor-All Buffer PLUS</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">74104</td>
			<td style="width:295px;">RNA cleanup protocol</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">WT-Ovation RNA amplification system</td>
			<td style="width:92px;">Nugen</td>
			<td style="width:137px;">2210-24</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">QIAquik PCR purification kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Material Name</td>
			<td style="width:92px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">GS30007G</td>
			<td style="width:295px;">Optional: autoloader</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">FS450</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Hybridization 640 Oven</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">640</td>
			<td style="width:295px;">Includes 4 GeneChip Probe array carriers</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:195px;">Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="232">
			<td height="232" style="height:232px;width:195px;">HERV-V2 chip</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Custom array. 
			For microarray availability (for research use only), please contact: 
			Fran&#231;ois Mallet 
			Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&#233;rieux 
			Medical Diagnostic Discovery Department 
			Centre Hospitalier Lyon Sud, B&#226;timent 3F 
			69495, Pierre B&#233;nite cedex France 
			Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 
			Email: francois.mallet@biomerieux.com</td>
		</tr>
		<tr height="717">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HERV-V2 conception 
			Dedicated database and annotations 
			 
			The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. 
			 
			Locus-specific probes design 
			Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. 
			 
			Custom HERV GeneChip microarray 
			The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer

El antígeno específico de la próstata (PSA) es el principal biomarcador de diagnóstico para el cáncer de próstata en el uso clínico, pero carece de especificidad y sensibilidad, particularmente en los valores de dosificación bajos 1. &quot;Cómo usar PSA &#39;continúa siendo un tema de actualidad, ya sea para el diagnóstico como una zona gris que corresponde a una concentración en suero de 2,5 a 10 ng / ml, que no permite una clara diferenciación que debe hacerse entre el cáncer y no cáncer 2 o para el seguimiento de pacientes -como el análisis de PSA postoperatorio parámetros cinéticos pueden plantear considerables retos para su aplicación en la práctica 3,4. Alternativamente, noncoding RNAs (ncRNAs) están emergiendo como moléculas clave en el cáncer humano, con el potencial de servir como nuevos marcadores de la enfermedad, por ejemplo, de PCA3 en el cáncer de próstata y 5,6 para revelar aspectos de la biología del tumor no caracterizados. Por otra parte, los datos del proyecto ENCODE publicados en 2012 mostraron que los diferentes tipos de ARN cubren cerca del 62% de la generaciónome. También parece que la cantidad de motivos reguladores de la transcripción es al menos 4,5 veces más alto que el correspondiente a los exones codificantes de proteínas. Por lo tanto, repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus endógenos humanos (HERV) constituyen una amplia gama de putativo / candidatos secuencias reguladoras de la transcripción, ya que es su función primaria en los retrovirus infecciosos. HERVs, repartidas a lo largo del genoma humano, se originan en infecciones ancestrales e independientes dentro de la línea germinal, seguidos de procesos de propagación de copiar y pegar, y que conducen a MultiCopy familias que ocupan el 8% del genoma humano (tenga en cuenta que los exones abarcan el 2% de nuestro genoma ). Algunos HERV loci todavía expresan proteínas que se han asociado con diversas patologías incluyendo el cáncer de 7-10. Hemos diseñado un microarray de alta densidad, en formato de Affymetrix, con el objetivo de caracterizar de manera óptima expresión loci HERV individual, con el fin de entender mejor si pueden ser activos, si conducen transcripción ncRNA o modulate de codificación de la expresión génica. Esta herramienta se ha aplicado en el campo del cáncer de próstata (Figura 1).

El valor de los estudios de transcriptómica reside principalmente en la calidad del material biológico de partida. Si la extracción de ARN se lleva a cabo en condiciones óptimas, el Número de la integridad del ARN (RIN) es típicamente de 7 o mayor (Figura 4A). La necesidad de hibridar 2 g de ADNc en el chip Affymetrix HERV-V2 implica el uso de un proceso de amplificación. Una etapa de amplificación exitosa conduce a una distribución en forma de campana (figura 4B). Entonces, la fragmentación Dnase1 se lleva a cabo con el fin de homogeneizar la distribución de tamaño de alrededor de 100 nucleótidos de ADNc antes de la hibridación (Figura 4C). Después de la hibridación y de barrido (Figura 4D), una inspección visual de la imagen permite a uno para comprobar si la red está bien alineado con los puntos (Figura 4E) y si los controles de hibridación son consistentes (Figura 4F). Este paso también es útil con el fin de excluir a los microarrays en el que las burbujas de aire o errores<html> ocurrido durante el experimento. Una vez que las fichas han pasado QC (Figura 5) y después de la normalización, el análisis estadístico de los 5 partidos par tumoral y normal de las muestras de ARN de la próstata en el Hospital de Lyon-Sud llevado a la identificación de 207 probesets HERV con los valores de expresión diferencial (p.val &lt;0,05) (Figura 6A). Para apoyar estos registros y para obtener información específico de la próstata, se añadieron 35 muestras partido pares adicionales (colon, ovario, testículo, mama, pulmón y próstata) para el análisis y el procedimiento SAM-FDR (Franklin Delano Roosevelt = 20%) finalmente identificado 44 prostáticos probesets HERV específicos. Entre ellos, las 10 estructuras HERV más relevantes se describen (Figura 6B). Se necesitan más estudios clínicos para evaluar los valores de sensibilidad y especificidad de estos biomarcadores candidatos. pload/50713/50713fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; . Figura 1 Esquema del procedimiento general de la clínica (1: prostatectomía por el médico y la preparación del tejido por el patólogo) al banco (2-6: preparación de muestras, la preparación de destino, el procesamiento de microarrays) que conduce a la identificación de biomarcadores candidatos (7: análisis de la bioinformática de los microarrays HERV). Los ácidos nucleicos derivados de tejido normal se representan en color naranja; ácidos nucleicos derivados de área tumoral se componen de una mezcla de la normalidad (naranja) y específicos del tumor (negro) los ácidos nucleicos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> . Figura 2 Concepción y el contenido del chip de HERV-V2: secuencias HERVobtenidos del genoma humano se almacenan en una base de datos llamada HERV-gDB3, entonces las sondas candidatos 25-mer pasan a través de un procedimiento de modelado hibridación dedicado (EDA +) antes de ser finalmente sintetizado en la matriz (las sub-regiones seleccionadas resultantes se representan para cada familia). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Manejo de próstata por el patólogo. (A) muestra la prostatectomía radical fresca se transfiere al laboratorio. (BC) La próstata está manchada (verde en el lado derecho, negro en la parte izquierda). (D) la sección transversal grande de la glándula en el lado posterior. (E) Dejando al margen intacto, piecES de tejidos se disecan a partir de diferentes áreas de la glándula de la próstata. (F) Los núcleos de tejido se colocan en un tubo Eppendorf. (G) hilo de sutura se utiliza para cerrar la próstata y para evitar la distorsión de la glándula y una interrupción mínima del margen quirúrgico. Entonces, el espécimen de prostatectomía radical está listo para la fijación en formol de acuerdo con el procedimiento habitual para el análisis histológico. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> Controles de la Figura 4. Calidad de la preparación de ácido nucleico y la eficiencia de hibridación. (A) la integridad del ARN, (B) de ADNc de objetivos y (c) objetivos fragmentados utilizadas en la etapa de hibridación amplificada. ThESE tres controles de calidad se obtuvieron con el Bioanalyzer utilizando chips de nano ARN y el ensayo del eucariota Nano Serie II. (D) la imagen general de la zona HERV-V2 microarrays de hibridación después de la digitalización, (E) la ampliación de las esquinas superior izquierda que muestra los controles de alineación de cuadrícula y (F) ampliación de la zona central que muestra la detección de controles de hibridación. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Procesamiento de señales. (A) de Affymetrix polyA espiga-en los controles de amplificación. El poli controla Dap, Thr, Phe y Lys transcripciones de B. genes subtilis se dispararon en la muestra de RNA y sirven para evaluar el éxito general<html> de los pasos de preparación de destino. La intensidad debe ser detectado con valores decrecientes de entre estos controles pico-a para asegurarse de que no había ningún sesgo durante la amplificación WT-Ovation entre altamente y genes de baja-expresado. (B) de Affymetrix espiga-en los controles de hibridación. Estos objetivos aislados a partir de E. coli y bacteriófago P1 se dispararon antes de que el procedimiento de etiquetado. El aumento de los valores de BioB, BioC, bioD y Cre indican el éxito general de la hibridación. (C) la distribución de intensidad de las señales de chips después de la normalización de RMA. La mayoría de los probesets señales de exhibición con valores inferiores a 2 6 (al fondo), lo que indica una expresión general restringido principalmente a algunos loci HERV específico. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figura 6. Análisis de los datos. (A) Análisis de agrupación jerárquica de las muestras normales y tumorales. Agrupación de particionamiento se aplicó a los valores de expresión normalizados utilizando un algoritmo de función de distancia euclidiana, agrupando probesets en un máximo (rojo) - y hacia abajo (azul)-regulación entre muestras normales y tumorales. (B) La selección de los 10 mejores estructuras HERV identificados como biomarcador candidato del cáncer de próstata. Para cada elemento HERV, la familia HERV relacionado, se dan las coordenadas genómicas (NCBI 36/hg18) y una breve descripción de la estructura HERV. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. </strong&gt; El repertorio HERV. (A) La secuenciación del genoma humano reveló 25.000 genes codificadores de proteínas (exones, 2%) y una gran cantidad de elementos de transposición, incluyendo 200.000 de larga repetición terminal (LTR) retrotransposones (HERV, 8%). (B) La extrapolación de HERV-V2 contenido de chip y los datos de expresión asociados (79 muestras procedentes de 8 normales frente a los tipos de tejidos tumorales) sugieren que una tercera parte del repertorio HERV es transcripcionalmente activo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> Figura 8. Interpretación funcional de señales desde el chip. (A) la identificación y el control epigenético Promotor: señal negativa U3 (sonda roja, 5&#39;LTR) Versus señal positiva R-U5 (azul sonda, 5&#39;LTR) sugieren la transcripción U3-impulsado, con el apoyo de los diferentes metilación CpG (círculos negros sólidos) contenido de U3 en peritumoral tejidos normales frente tumorales. (B) La estrategia de fusión: la supuesta dotación de 3,1 kb que codifica ARNm expresa exclusivamente en el tumor se identifica usando SD1/SA2 empalme sonda superpuestas. * Deducida por la comparación con otros tejidos no placentarios. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Retrovirus endógenos humanos (HERV), que ocupan 8% del genoma humano, conservan la capacidad de codificación de los escasos pero cien mil repeticiones terminales largas (LTRs). A Affymetrix microarray costumbre fue diseñado para identificar la expresión locus HERV individual y se utilizó en los tejidos de cáncer de próstata como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.

La identificación basada en microarrays de expresión individual HERV Loci: Aplicación al descubrimiento de biomarcadores en el cáncer de próstata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Investigación

Medicina

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

El aislamiento de las células madre del cáncer de muestras de cáncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Implementación de precisión de pruebas mínimas de dosis de eritema (MED) para evaluar la variación individual en la respuesta inflamatoria humana

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...