Name: functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Vi takker C. Montojo, J. Reyes, og M. Armour til teknisk rådgivning og bistand. Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud F31 NS063550 (DAL), en Basil O&#39;Connor Starter Scholar Award og tilskud fra det Klingenstein fonden og NARSAD (til SB). SB er en WM Keck Distinguished Young Scholar i medicinsk forskning.

Animal Brug Indhente godkendelse fra institutionelle Animal Care og brug Udvalg for standard pleje og brug protokoller. Den nuværende protokol blev udviklet til fokale bestråling undersøgelser 5,5-10 uger gamle voksne C57BL6 / J-mus, som tidligere beskrevet (figur 2) 2. Men andre aldre og kan også bruges mindre dyrearter (rotter, hamstere, jorden egern, osv.), forudsat at effektive anæstesi protokoller og en radiografiske referencepunkter atlas muliggø...

CT-vejledt omdrejningspunkt bestråling (CFIR) er et nyt og komplet system tilgang stand til at levere strålingsfelter til mål i små dyr under robot styring med CT-vejledning 32. Evnen til CFIR til at levere meget fokuseret bjælker til små dyremodeller giver nye forskningsmuligheder at bygge bro laboratorium forskning og klinisk oversættelse. Dette papir beskriver CFIR tilgang til præcis stråling levering til specifikt at målrette en hypothalamus neural progenitorpopulationen. Vi viser her, hvordan m...

Nylige opdagelser har vist, at pattedyrs hjerne voksen kan undergå en bemærkelsesværdig grad af plasticitet. Voksen-fødte neuroner er genereret gennem hele voksenlivet i specialiserede nicher af pattedyrhjernen 1.. Hvad er funktionen af ​​disse voksen-fødte neuroner? Og så meget mere, de spiller en rolle i fysiologi og adfærd? Undersøgelser om dette emne har traditionelt fokuseret på subventricular zone af de laterale ventrikler og subgranular zone af hippocampus, men de seneste undersøgelser har karakteriseret neurogenese i andre områder af hjernen, såsom pattedyr hypothalamus 2. Neurogenese er blevet rapporteret i den postnatale og voksne hypothalamus 2-10, og funktionen af disse nyfødte hypothalamus neuroner forbliver et aktivt område af undersøgelsen. Den funktionelle karakterisering af voksen-fødte neuroner er fortsat en stor udfordring for neurovidenskab felt i almindelighed. Selektiv hæmning af specIFIC neurale progenitorpopulationer fortsat begrænset af manglen på tilgængelige molekylære markører, der er unikke for enlige neurale progenitorpopulationer 11. Derfor er det stadig svært selektiv sletning af voksen-fødte neuroner fra disse neurale stamfædre via genetisk målretning. Ligeledes viral levering at målrette voksen-fødte neuroner lider potentielle konfoundere såsom indførelse af skader og betændelse i miljøet 12.. Nye radiologiske værktøjer dukker dog, at tillader en at omgå disse forvirrer og undersøge disse spørgsmål gennem nøjagtig og præcis anatomisk målretning i små dyr. Ioniserende stråling hæmmer fødsel og differentiering af nye neuroner, og tillader en ikke-invasiv metode til at målrette neurale progenitorpopulationer 13-15. For nylig beskrev vi et germinale region af pattedyr hypothalamus median eminence (ME), vi betegnes hypothalamus proliferative zone (HPZ) 2. </sup&gt;. Vi fandt, at når unge voksne hunmus fik en fedtrig kost (HFD), niveauer af neurogenese i HFD-fodret mus var væsentligt højere end deres normale chow (NC) fodret kontrol på dette ME region 2. For at teste om voksen neurogenese inden hypothalamus ME regulerer stofskiftet og vægt, vi søgte at forstyrre denne proces. Medianen eminence er en lille ensidig struktur på bunden af ​​tredje ventrikel, hvorfra regulerende hormoner, der frigives. For at hæmme proliferation og efterfølgende neurogenesis uden at ændre de andre fysiologiske funktioner i dette område af hjernen, vi udviklede en invasiv omdrejningspunkt bestråling teknik til selektivt at hæmme fødslen af nyfødte voksne neuroner i hypothalamus median eminence 2. En række grupper har ansat stråling at undertrykke neurogenesis i kanoniske regioner 14-28. Imidlertid har tidligere radiologiske tilgange generelt målrettet store områder, eller oftenn utilsigtet også målrettet flere områder i hjernen, hvor neurogenese er blevet rapporteret, hvilket gør det vanskeligt entydigt at knytte eventuelle adfærdsmæssige defekter observeret med defekter i specifikke neurale progenitorpopulationer. Muligheden for mere målrettet bestråling leveres af radiologiske platforme, der kombinerer c omputer tomografi-guidet billeddannelse med f ocal stråle ir stråling (CFIR) levering for at muliggøre præcis anatomisk målretning 29-36. Stråling bjælker så små som 0,5 mm i diameter er til rådighed til at målrette specifikke neurale progenitorpopulationer 35. Denne metode giver os mulighed for at målrette hypothalamus ME og arrestere spredning og blokere neurogenesis i små dyr. Efter radiologisk behandling på disse progenitorpopulationer kan fysiologiske og adfærdsmæssige test skal udføres for at belyse den potentielle funktion af voksne-fødte celler. Focal målretning er især vigtigt for vores ansøgning sidenhypofysen ligger tæt på hypothalamus median eminence, bestråling af hypofysen kan påvirke hormonal funktion og efterfølgende forvirre resultaterne. Det biologiske grundlag for undertrykkelse af neurogenese efter bestråling stadig uklart. Tidligere stråling undersøgelser har påberåbt sig stort område bjælker, og har konkluderet, at undertrykkelsen af neurogenese er medieret gennem en inflammatorisk reaktion 14, 37.. Som sådan er det uklart, om meget fokal bestråling kunne undertrykke neurogenese, da det ikke fremkalde en betydelig inflammatorisk reaktion. Imidlertid har nyere undersøgelser fra vores gruppe af den klassiske neurogen region i hippocampus vist, at meget fokal bestråling med en dosis på 10 Gy kan undertrykke neurogenesis i mindst 4 uger efter bestråling 35. At afhøre funktionen af ​​voksen-fødte hypothalamus neuroner i median eminence, bruger vi en præcision stråling device stand til at levere CT-scanning i kombination med lille diameter stråling bjælker til at inhibere ME neurogenese. Ved hjælp af en røntgen-rør fastgjort til en portalkran, der roterer over et område på 360 ° vi leverer bue-formede mikro bestråling stråle med anvendelse af et robotstyret prøvebordet, der tillader drejning af et dyr under strålebehandling (figur 1) . En høj opløsning røntgen-detektor anvendes til at erhverve billeder, når gantry er i vandret position 33. Til denne undersøgelse blev CT-billeder rekonstrueret med en isotropisk voxelstørrelse på 0,20 mm. On-board CT-scanning tillod identifikation af et mål, mens dyret er i behandlingen position. Målet blev lokaliseret ved hjælp af CT-navigation dosis-planlægning software, der var inkluderet i vores kommercielt tilgængelige radiologisk platform. Efter at lokalisere vores ROI ved CT-scanning, blev dyret flyttet til den rette behandling stilling ved robot modellen fase, der har fire degRees frihed (X, Y, Z, θ). Gennem en kombination af gantry og robot fase vinkler, kan bjælker leveres fra næsten en hvilken som helst retning i forhold til dyret, og stereotaktiske bue-lignende behandlinger er mulige 29. For disse og alle andre billeddannende undersøgelser blev mus anbragt i et immobilisering enhed, der tillader levering af bedøvelsesmiddel isofluran gas, mens begrænse bevægelse. Immobiliseringsprocessen seng er CT-kompatibel og tilsluttes til den robot modellen trin 34.. Vi forventer, at CFIR vil give konceptuelle fremskridt på en række forskningsområder. Selvom vi bruger radiologisk målretning af hypothalamus median eminence som bevis på princippet om denne teknik, kan CFIR bruges til at målrette en region af kroppen af ​​enhver lille model organisme i princippet. I neurovidenskab, for eksempel, vi forestiller denne teknik kan bruges til at vurdere funktionen af ​​aktivt proliferative progenitorpopulationer der er blevet foreslået til eksistet andre circumventricular organer, såsom området postrema 38, 39, subfornikale organ 40 og hypofysen 41. Langvarige kontroverser om den funktionelle rolle af voksne neurogenese og identificere en kausal rolle i adfærd kan nu også blive bedre behandlet. I sangfugl kan denne teknik omhandle den rolle af voksne neurogenese i at bevare den robuste og sæsonbetonede adfærd fuglesang 42, som har været hæmmet af evnen til selektivt at hæmme neurogenesis i bestemte områder af hjernen. Forståelse denne robuste adfærdsmæssige model kan kaste ny indsigt i den rolle, voksne neurogenese i reguleringen af ​​andre seksuelt dimorfe adfærd. Alternativt i den metaboliske område CFIR kan anvendes til at undersøge aspekter af den rolle af hepatocytproliferation og dens rolle i stofskiftet og energibalance. Muligheden for konceptuelle fremskridt i flere forskningsdiscipliner forstærkes af indførelsen af ​​denne teknik. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; I dette papir, vi demonstrere mulighederne CFIR til præcision anatomisk målretning af et samlingspunkt bestråling stråle. Selvom vi oprindeligt udviklet denne lille dyr stråling forskningsplatform (SARRP) for vores studier, er andre lignende enheder nu kommercielt tilgængelige, der kan udføre lignende CT-vejledt omdrejningspunkt bestråling 43, 44. Derfor har vi generalisere denne CFIR protokol med trin, der kræves for alle forsknings-platforme snarere end dem, der er specifikke for SARRP. Fordelene ved CFIR end tidligere radiologiske fremgangsmåder til at inhibere neurogenese er, at denne teknik tillader tredimensionel volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af dosis konform dosis minimerer udsættelse for nontargeted hjerneregioner, og høj præcision stråle geometri tillader konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Vi skitsere, hvordan at bruge CT-vejledt imaging at målrette dosis til en specifik anatomisk region, og ved at gøre det, hvordan man kan visualisere strålingdosisfordeling direkte i væv ved hjælp af immunhistokemisk farvning for γ-H2AX, en markør af DNA dobbelt-strenget pauser 35, 45-48. Brugen af ​​denne metode til selektiv bestråling af neurogene nicher kan have betydelige konsekvenser afsløre funktionelle rolle af nye voksen-fødte neuroner på fysiologi og sygdom.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

Den funktionelle karakterisering af voksne født neuroner fortsat en stor udfordring. Tilgange til at hæmme voksen neurogenese via invasive viral levering eller transgene dyr har potentielle confounds der gør fortolkning af resultater fra disse undersøgelser vanskelig. Nye radiologiske værktøjer dukker dog, at tillader en at noninvasively undersøge funktionen af ​​udvalgte grupper af voksne-fødte neuroner gennem nøjagtig og præcis anatomisk målretning i små dyr. Focal ioniserende stråling hæmmer fødsel og differentiering af nye neuroner og tillader målretning af specifikke neurale progenitor regioner. For at belyse den potentielle funktionelle rolle, at voksne hypothalamus neurogenese spiller i reguleringen af ​​fysiologiske processer, vi udviklede en invasiv omdrejningspunkt bestråling teknik til selektivt at hæmme fødslen af ​​voksen-fødte neuroner i hypothalamus median eminence. Vi beskriver en metode til C omputer tomografi-vejledtf ocal ir stråling (CFIR) levering for at muliggøre præcis og nøjagtig anatomisk målretning i små dyr. CFIR bruger tre-dimensionelle volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af den strålingsdosis, minimerer bestråling nontargeted områder af hjernen, og giver mulighed for konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Denne protokol tillader en at stille spørgsmål om funktionen af ​​voksen-fødte neuroner, men åbner også områder til spørgsmål omkring radiobiologien, tumor biologi og immunologi. Disse radiologiske værktøjer vil lette oversættelsen af ​​opdagelser på bænken til sengekanten.

Vurdere CT-vejledt målretning og Nøjagtighed Den mekaniske kalibrering af systemet er kritisk for at sikre, at stråler fra forskellige vinkler alle skærer hinanden i et enkelt punkt. Kalibrering blev udført med en halvautomatisk imaging-baserede metode, hvor ende-til-ende tilpasning nøjagtigheden er blevet målt til at være 0,2 mm 29. Denne nøjagtighed er yderst kritisk, da mængden af hypothalamus median eminence struktur er lille 2. For at teste denne kalibrering...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Funktionen af ​​pattedyr neuroner voksen-fødte er fortsat et aktivt område af undersøgelsen. Ioniserende stråling hæmmer fødslen af ​​nye neuroner. Ved hjælp af computer tomografi-guidede omdrejningspunkt bestråling (CFIR), kan tre-dimensionelle anatomisk målretning af specifikke neurale progenitorpopulationer nu bruges til at vurdere den funktionelle rolle af voksne neurogenese.

Funktionel Interrogation Adult Hypothalamus Neurogenese med Focal Radiological Hæmning

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Metoder til Modulation og analyse af NF-KB-afhængige Adult Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionel Imaging af Auditory Cortex i voksne katte ved hjælp af High-felt fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stiksår Skade af zebrafisk Adult telencephalon: En metode til at undersøge Vertebrate Brain Neurogenese og Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-foton Intracellulær Natrium Imaging Kombineret med UV-medieret Focal Uncaging af glutamat i CA1 pyramideneuroner

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunohistokemi og Multiple Mærkning med antistoffer fra den samme vært Arter at studere Voksen Hippocampal Neurogenese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Vurdering Primær Neurogenese i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoner Brug Immunfarvning

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

Online transkranial magnetisk Stimulation protokol til måling af kortikal fysiologi tilknyttet svar hæmning

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...