Name: functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Wij danken C. Montojo, J. Reyes, en M. Armour voor technisch advies en bijstand. Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health subsidie ​​F31 NS063550 (naar DAL), een Basil O&#39;Connor Starter Scholar Award en subsidies van de Klingenstein Fonds en NARSAD (SB). SB is een WM Keck Distinguished Young Scholar in Medical Research.

Animal Gebruik Verkrijgen goedkeuring van institutionele Animal Care en gebruik Comite voor standaard zorg en gebruik protocollen. Het huidige protocol is ontwikkeld voor focale stralingsstudies op 5,5-10 weken oude volwassen C57BL6 / J muizen zoals eerder beschreven (figuur 2) 2. Echter, andere leeftijden en kleine diersoorten (ratten, hamsters, grondeekhoorns, etc.) kunnen ook worden gebruikt, op voorwaarde dat doeltreffende anesthesie protocollen en een r...

CT-geleide focale bestraling (CFIR) is een nieuwe en compleet systeem benadering kan leveren straling velden om doelen in kleine dieren onder robotachtige controle met behulp van CT-begeleiding 32. Het vermogen van CFIR om zeer gerichte bundels te leveren aan kleine diermodellen biedt nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar het laboratorium onderzoek en klinische vertaling te overbruggen. Dit document beschrijft de CFIR aanpak voor exacte bestraling levering specifiek te richten een hypothalamus neurale voor...

Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat de volwassen hersenen van zoogdieren een opmerkelijke mate van plasticiteit kan ondergaan. -Volwassen geboren neuronen worden gegenereerd door volwassenheid in gespecialiseerde niches van de hersenen van zoogdieren 1. Wat is de functie van deze volwassen geboren neuronen? En meer nog, ze een rol in de fysiologie en gedrag spelen? Studies over dit onderwerp zijn van oudsher gericht op de subventricular zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de hippocampus, maar recente studies hebben neurogenese gekenmerkt in andere hersengebieden zoals de zoogdieren hypothalamus 2. Neurogenese is gemeld bij de postnatale en volwassen hypothalamus 2-10, en de functie van deze pasgeboren neuronen van de hypothalamus blijft een actief gebied van onderzoek. De functionele karakterisering van volwassen geboren neuronen blijft een belangrijke uitdaging voor het veld neurowetenschappen in het algemeen. Selectieve remming van specific neurale voorlopercellen bevolking blijft beperkt door het gebrek aan beschikbare moleculaire merkers die uniek zijn voor enkele neurale voorlopercellen bevolking 11 zijn. Zo selectieve verwijdering van volwassen geboren neuronen van deze neurale voorlopercellen via genetische targeting blijft moeilijk. Ook virale levering aan-volwassen geboren neuronen richten lijdt aan potentiële verstorende variabelen zoals de invoering van verwondingen en ontstekingen in het milieu 12. Nieuwe radiologische gereedschappen zijn in opkomst, echter, die het mogelijk maken een tot deze verwart omzeilen en onderzoeken deze vragen door middel van nauwkeurige en precieze anatomische targeting in kleine dieren. Ioniserende straling remt de geboorte en differentiatie van nieuwe neuronen en maakt een niet-invasieve methode om neurale populaties richten 13-15. Onlangs beschreven we een germinal regio van de zoogdieren hypothalamus mediaan eminentie (ME) die wij genoemd de hypothalamus proliferatieve zone (HPZ) 2 </sup&gt;. We vonden dat wanneer jonge vrouwelijke muizen volwassen kregen een vetrijk dieet (HFD), niveaus van neurogenese in HFD-gevoede muizen waren aanzienlijk hoger dan hun normale voer (NC) gevoed controles op dit ME regio 2. Om te testen of volwassen neurogenese in de hypothalamus ME reguleert de stofwisseling en gewicht, hebben we getracht dit proces te verstoren. De mediane eminentie een klein eenzijdige structuur aan de basis van de derde ventrikel waaruit regulerende hormonen vrijkomen. Om wildgroei en de daaropvolgende neurogenese remmen zonder dat de andere fysiologische functies van dit hersengebied, ontwikkelden we een niet-invasieve focale bestraling techniek om de geboorte van de nieuw geboren volwassen neuronen in de hypothalamus mediaan eminentie 2 selectief remmen. Een aantal groepen in dienst straling om neurogenese te onderdrukken in canonieke regio&#39;s 14-28. Echter, vorige radiologische benaderingen algemeen gerichte grote gebieden, of often onbedoeld ook gerichte verschillende hersengebieden waar neurogenese gerapporteerd, waardoor het moeilijk om ondubbelzinnig koppelen elke gedragstekorten waargenomen defecten in specifieke neurale populaties. De mogelijkheid om meer gerichte bestraling wordt geleverd door radiologische platforms die c omputer-tomografie begeleide imaging combineren met f ocal bundel ir straling (CFIR) levering aan precieze anatomische targeting 29-36 mogelijk te maken. Stralingsbundels zo klein als 0,5 mm in diameter zijn specifieke neurale populaties 35 richten. Deze methode laat ons toe om de hypothalamus ME richten en te arresteren proliferatie en blokkeren neurogenese in kleine dieren. Na radiologische behandeling van deze voorlopercellen bevolking, kan fysiologische en gedragsmatige testen worden uitgevoerd om de potentiële functie van volwassen geboren cellen te verlichten. Focal targeting is vooral belangrijk voor onze toepassing, omdat dehypofyse ligt dicht bij de hypothalamus mediaan eminentie, bestraling van de hypofyse kan hormonale functie beïnvloeden en vervolgens de resultaten te beschamen. De biologische basis voor de onderdrukking van neurogenese na bestraling nog steeds onduidelijk. Vorige straling studies hebben zich op grote oppervlakte balken, en hebben geconcludeerd dat de onderdrukking van neurogenese wordt gemedieerd door een ontstekingsreactie 14, 37. Als zodanig is het onduidelijk of zeer focale bestraling neurogenese kan onderdrukken, aangezien geen aanzienlijke ontstekingsreactie opwekken. Echter, recente studies door onze groep van de klassieke neurogene gebied in de hippocampus hebben aangetoond dat zeer focale bestraling met een dosis van 10 Gy neurogenese kan onderdrukken gedurende tenminste 4 weken na bestraling 35. Om de functie van volwassen geboren neuronen van de hypothalamus in de mediaan eminentie ondervragen, maken we gebruik van een precisie straling device kan leveren CT beeldvorming in combinatie met een kleine diameter stralingsstralen om neurogenese te remmen ME. Met een röntgenbuis gekoppeld aan een portaal dat draait over een bereik van 360 °, leveren wij arc-beam micro bestraling licht met behulp van een robot gestuurde Model fase waardoor rotatie van een dierlijke patiënt tijdens bestraling (figuur 1) . Een hoge resolutie röntgendetector wordt gebruikt om beelden te verkrijgen wanneer de balk in de horizontale stand 33. Voor dit onderzoek werden CT beelden gereconstrueerd met een isotrope voxel grootte van 0,20 mm. On-board CT kon de identificatie van een doel, terwijl het dier de behandeling plaats. De doelstelling werd gelokaliseerd met behulp van de CT navigatie dosis-planning software, die was met onze commercieel beschikbare radiologische platform. Na het lokaliseren van onze ROI door CT-beeldvorming, werd het dier naar de juiste behandeling positie bewogen door de robotachtige specimen stadium dat vier graden heeftrees van vrijheid (X, Y, Z, θ). Door een combinatie van portaal en robot fase hoeken kunnen stralen worden geleverd vanuit bijna elke richting ten opzichte van het dier en stereotactische boogvormige behandelingen mogelijk 29. Voor deze en alle andere beeldvormende onderzoeken, werden de muizen geplaatst in een immobilisatie-apparaat dat de levering van verdoving isofluraan gas toestaat terwijl het beperken van beweging. De immobilisatie bed is CT-compatibel, en maakt verbinding met de robot monster etappe 34. We verwachten dat CFIR conceptuele vooruitgang zal bieden in een aantal onderzoeksgebieden. Hoewel we gebruik van radiologische targeting van de hypothalamus mediaan eminentie als bewijs van het principe van deze techniek, kan CFIR worden gebruikt om een ​​deel van het lichaam van een klein model organisme in principe richten. In de neurologie, bijvoorbeeld ogen we deze techniek kan worden gebruikt om de functie van actief proliferatieve voorlopercellen populaties die zijn voorgesteld exis evaluerent in andere circelvormige, zoals het gebied postrema 38, 39, subfornicaal orgaan 40 en de hypofyse 41. Langdurige controverses over de functionele rol van de volwassen neurogenese en het identificeren van een causale rol in het gedrag kan nu ook beter worden aangepakt. In zangvogel, kan deze techniek de rol van volwassen neurogenese behoud van de robuuste en seizoensgedrag van de vogels 42 die wordt belemmerd door het vermogen om selectief te remmen neurogenese in specifieke hersengebieden pakken. Inzicht in deze robuuste behavioral model zou nieuw inzicht te werpen op de rol van de volwassen neurogenese in het reguleren van andere seksueel dimorf gedrag. Ook bij het metabool gebied CFIR kan worden gebruikt om aspecten van de rol van de proliferatie van levercellen en zijn rol in het metabolisme en energiebalans verkennen. De mogelijkheid voor conceptuele vooraf verschillende onderzoeksdisciplines wordt verbeterd door de introductie van deze techniek. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; In dit artikel laten we zien de mogelijkheden van CFIR voor nauwkeurige anatomische targeting van een focale bestraling balk. Hoewel we in eerste instantie ontwikkeld dit kleine dier straling onderzoeksplatform (SARRP) voor onze studies, andere soortgelijke apparaten zijn nu commercieel beschikbaar die vergelijkbaar-CT-geleide focale bestraling 43, 44 kunnen bereiken. Vandaar generaliseren we dit CFIR protocol met stappen die nodig zijn voor alle research platforms in plaats van die specifiek voor SARRP. De voordelen van CFIR dan eerdere benaderingen radiologische neurogenese remmen zijn dat deze techniek maakt driedimensionale volumetrische beeldbegeleiding voor lokalisatie en richten van de dosis, conforme dosis minimaliseert blootstelling aan nontargeted hersengebieden en hoge precisie balansgeometrie maakt conforme dosisverdeling met scherpe bundel grenzen. We geven een overzicht van CT-geleide beeldvorming gebruiken om de dosis te richten op een bepaalde anatomische regio, en op die manier hoe de straling te visualiserendosisverdeling direct in weefsel met behulp van immunohistochemische kleuring voor γ-H2AX, een merker van DNA dubbelstrengs breuken 35, 45-48. Het gebruik van deze benadering voor selectieve bestraling van neurogene niches belangrijke implicaties kunnen hebben in het openbaren van de functionele rol van nieuwe volwassen geboren neuronen op fysiologie en ziekte.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

De functionele karakterisering van volwassen geboren neuronen blijft een belangrijke uitdaging. Benaderingen van volwassen neurogenese te remmen via invasieve virale levering of transgene dieren hebben potentiële verwart dat de interpretatie van de resultaten moeilijk te maken uit deze studies. Nieuwe radiologische gereedschappen zijn in opkomst, echter, die het mogelijk maken een om niet-invasief onderzoek naar de functie van geselecteerde groepen van volwassen geboren neuronen door middel van nauwkeurige en precieze anatomische targeting in kleine dieren. Focal ioniserende straling remt de geboorte en differentiatie van nieuwe neuronen en kan targeting van specifieke neurale gebieden. Met het oog op de mogelijke functionele rol die volwassen hypothalamus neurogenese speelt in de regulatie van fysiologische processen belichten, ontwikkelden we een niet-invasieve focale bestraling techniek om de geboorte van volwassen geboren neuronen in de hypothalamus mediaan eminentie selectief remmen. We beschrijven een werkwijze voor C omputer-tomografie geleidef okale ir straling (CFIR) levering aan precieze en accurate anatomische targeting in kleine dieren mogelijk te maken. CFIR maakt gebruik van drie-dimensionale volumetrische beeldgeleiding voor lokalisatie en de gerichtheid van de stralingsdosis, minimaliseert de blootstelling aan straling te nontargeted hersengebieden, en zorgt voor conforme dosisverdeling met scherpe bundel grenzen. Dit protocol maakt het mogelijk om vragen met betrekking tot de functie van volwassen geboren neuronen vragen, maar opent ook gebieden op vragen op het gebied van radiobiologie, tumor biologie en immunologie. Deze radiologische instrumenten zal de vertaling van de ontdekkingen op de bank te vergemakkelijken aan het bed.

Het beoordelen van CT-geleide targeting en nauwkeurigheid De mechanische kalibratie van het systeem is essentieel voor dat bundels vanuit verschillende invalshoeken alle kruisen in een punt. Kalibratie werd uitgevoerd met een semi-automatische imaging gebaseerde methode, waarbij end-to-end nauwkeurigheid uitlijning werd gemeten als 0,2 mm 29. Deze nauwkeurigheid is zeer kritisch als het volume van de hypothalamus mediaan eminentie structuur is klein 2. Om deze kalibratie t...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

De functie van zoogdieren neuronen-volwassene geboren blijft een actief gebied van onderzoek. Ioniserende straling remt de geboorte van nieuwe neuronen. Met computer-tomografie geleide focale bestraling (CFIR), kunnen driedimensionale anatomische targeting van specifieke neurale populaties nu worden gebruikt om de functionele rol van volwassen neurogenese beoordelen.

Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functionele Mapping met gelijktijdige MEG en EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Functionele Beeldvorming van de auditieve cortex in volwassen katten met behulp van High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-foton intracellulaire Natrium Imaging In combinatie met UV-gemedieerde Focal uncaging van glutamaat in CA1 pyramidale neuronen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Het beoordelen van Primary neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s met behulp van Immunokleuring

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

Online Transcraniële magnetische stimulatie Protocol voor het meten van de corticale fysiologie gekoppeld respons inhibitie

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...