Name: functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00
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Ringraziamo C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour per la consulenza e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da US National Institutes of Health di sovvenzione F31 NS063550 (a DAL), un Premio Basilio O&#39;Connor Starter Scholar e sovvenzioni del Fondo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB è un WM Keck Distinguished giovane studioso nella ricerca medica.

Uso Animal Ottenere l&#39;approvazione dal Comitato istituzionale, cura degli animali ed uso di protocolli di cura standard di utilizzo. Il protocollo attuale è stato sviluppato per studi di irradiazione focali 5,5-10 settimane di età adulte C57BL6 / J topi, come precedentemente descritto (Figura 2) 2. Tuttavia, altre epoche e le piccole specie animali (ratti, criceti, scoiattoli di terra, ecc) possono essere utilizzati anche, a condizione che i protocolli...

Irradiazione focale TC-guidata (CFIR) è un approccio nuovo e completo sistema in grado di fornire campi di radiazione a obiettivi nei piccoli animali sotto controllo robotico con CT-guida 32. La capacità di CFIR di fornire fasci altamente mirati per piccoli modelli animali offre nuove opportunità di ricerca per colmare laboratorio di ricerca e traduzione clinica. Questo documento descrive l&#39;approccio CFIR per la consegna di radiazione preciso per indirizzare specificamente una popolazione progenitore n...

Recenti scoperte hanno dimostrato che il cervello dei mammiferi adulti può subire un notevole grado di plasticità. Neuroni nati adulti, vengono generati durante l&#39;età adulta in nicchie specializzate del cervello dei mammiferi 1. Qual è la funzione di questi neuroni adulti nati? E tanto più, non giocano un ruolo nella fisiologia e del comportamento? Studi su questo argomento sono tradizionalmente focalizzati sulla zona subventricular dei ventricoli laterali e la zona subgranulare dell&#39;ippocampo, tuttavia, studi recenti hanno caratterizzato neurogenesi in altre regioni del cervello come l&#39;ipotalamo mammifero 2. Neurogenesi è stata riportata nel postnatale e adulta ipotalamo 2-10, e la funzione di questi neuroni ipotalamici neonati rimane un&#39;area attiva di ricerca. La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa per il campo delle neuroscienze in generale. L&#39;inibizione selettiva di specific popolazioni progenitrici neurali resta limitata dalla mancanza di marcatori molecolari disponibili che sono unici per singole popolazioni progenitrici neurali 11. Così, l&#39;eliminazione selettiva dei neuroni adulti nati da questi progenitori neurali tramite il targeting genetico rimane difficile. Allo stesso modo, la consegna virale di indirizzare neuroni adulti nati soffre di potenziali variabili confondenti quali l&#39;introduzione di lesioni e infiammazioni nell&#39;ambiente 12. Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di aggirare queste confonde e indagare queste domande attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni, e permette un metodo non invasivo per indirizzare le popolazioni progenitrici neurali 13-15. Recentemente, abbiamo descritto una regione germinale dell&#39;eminenza mediana dell&#39;ipotalamo mammiferi (ME) che abbiamo chiamato la zona proliferativa ipotalamico (HPZ) 2 </sup&gt;. Abbiamo scoperto che quando i giovani topi femmina adulti sono stati dati una dieta ricca di grassi (HFD), i livelli di neurogenesi nei topi HFD-alimentati erano nettamente superiori a loro chow normale (NC) controlli alimentati in questa regione ME 2. Per verificare se neurogenesi adulta all&#39;interno della ME ipotalamo regola il metabolismo e il peso, abbiamo cercato di interrompere questo processo. L&#39;eminenza mediana è una piccola struttura unilaterale alla base del terzo ventricolo da cui vengono rilasciati ormoni regolamentazione. Al fine di inibire la proliferazione e la successiva neurogenesi senza alterare le altre funzioni fisiologiche di questa regione del cervello, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti appena nati nel eminenza mediana ipotalamico 2. Un certo numero di gruppi hanno impiegato radiazione per sopprimere la neurogenesi nelle regioni canonici 14-28. Tuttavia, gli approcci radiologici precedenti hanno generalmente mirata grandi aree, o often involontariamente preso di mira anche diverse aree cerebrali in cui e &#39;stato segnalato neurogenesi, il che rende difficile associare in modo univoco tutti i difetti comportamentali osservati con difetti in specifiche popolazioni progenitrici neurali. La capacità di irradiazione più mirato è fornito dalle piattaforme radiologiche che combinano c omputer tomografia guidata con radiazioni Ocal f fascio ir (CFIR) la consegna per consentire precisa anatomica di targeting 29-36. Fasci di radiazioni fino a 0,5 mm di diametro sono a disposizione per indirizzare specifiche popolazioni progenitrici neurali 35. Questa metodologia ci permette di indirizzare il ME ipotalamo e l&#39;arresto della proliferazione e blocchiamo la neurogenesi nei piccoli animali. Dopo il trattamento radiologico nelle popolazioni progenitrici, prove funzionali e comportamentali possono essere eseguite per illuminare la funzione potenziale di cellule adulte-nato. Il targeting focale è particolarmente importante per la nostra applicazione in quanto laghiandola pituitaria si trova vicino alla eminenza mediana dell&#39;ipotalamo, irradiazione dell&#39;ipofisi può influenzare la funzione ormonale e successivamente confondere risultati. La base biologica per la soppressione della neurogenesi dopo irradiazione rimane ancora poco chiaro. Gli studi di radiazione precedenti hanno fatto affidamento su grandi travi della zona, e hanno concluso che la soppressione della neurogenesi è mediata da una risposta infiammatoria 14, 37. Come tale non è chiaro se l&#39;irradiazione altamente focale potrebbe sopprimere la neurogenesi, dal momento che non evoca una risposta infiammatoria notevole. Tuttavia, studi recenti nostro gruppo del classico regione neurogenica nell&#39;ippocampo hanno dimostrato che l&#39;irradiazione altamente focale con una dose di 10 Gy può sopprimere neurogenesi per almeno 4 settimane dopo l&#39;irradiazione 35. Per interrogare la funzione di adulti nati neuroni ipotalamici nella eminenza mediana, usiamo una radiazione di precisione device in grado di erogare TC in combinazione con piccolo diametro fasci di radiazioni per inibire ME neurogenesi. L&#39;utilizzo di un tubo a raggi X attaccato ad un cavalletto che ruota in un intervallo di 360 °, trasportiamo arco-Trave micro irradiazione con l&#39;uso di un portaoggetti controllato robot che permette la rotazione di un soggetto animale durante il trattamento con radiazioni (Figura 1) . Un rivelatore di raggi X ad alta risoluzione viene utilizzato per acquisire immagini quando il cavalletto è in posizione orizzontale 33. Per questo studio, immagini CT sono state ricostruite con una dimensione voxel isotropico di 0.20 mm. Bordo TC permesso l&#39;identificazione di un obiettivo, mentre l&#39;animale è in posizione di trattamento. L&#39;obiettivo è stato localizzato utilizzando il software di navigazione CT dose di pianificazione, che era inclusa con il nostro disponibile in commercio piattaforma radiologica. Dopo localizzazione nostro ROI TC, l&#39;animale è stato spostato nella posizione di trattamento appropriato dal portaoggetti robotico che ha quattro gradiRees di libertà (X, Y, Z, θ). Attraverso una combinazione di angoli gantry e stage robot, le travi possono essere forniti da quasi qualsiasi direzione rispetto per l&#39;animale, e trattamenti ad arco-like stereotassica sono possibili 29. Per questi e altri studi di imaging, i topi sono stati posizionati in un dispositivo di immobilizzazione che consente l&#39;erogazione di gas anestetico isoflurano mentre limita il movimento. Il letto immobilizzazione è compatibile CT, e si connette al portaoggetti robotico 34. Ci aspettiamo che CFIR fornirà anticipazioni concettuali in un certo numero di aree di ricerca. Anche se usiamo il targeting radiologica dell&#39;eminenza mediana ipotalamico come prova di principio di questa tecnica, CFIR può essere utilizzato per mirare qualsiasi regione del corpo di qualsiasi piccola organismo modello in linea di principio. Nelle neuroscienze, per esempio, prevediamo questa tecnica può essere utilizzata per valutare la funzione di popolazioni progenitrici attivamente proliferanti che sono state proposte per esit in altri organi circumventricolari, come l&#39;area postrema 38, 39, organo subfornicale 40, e l&#39;ipofisi 41. Controversie di lunga data per quanto riguarda il ruolo funzionale della neurogenesi adulta e che identificano un ruolo causale nel comportamento possono ora essere meglio affrontati. In songbird, questa tecnica potrebbe riguardare il ruolo di neurogenesi nel mantenere il comportamento robusta e stagionale degli uccelli 42, che è stato ostacolato dalla capacità di inibire selettivamente neurogenesi in specifiche regioni cerebrali. La comprensione di questo modello comportamentale robusta potrebbe gettare nuova visione del ruolo della neurogenesi adulta nel regolare altri comportamenti dimorfismo sessuale. In alternativa, nel campo metabolico, CFIR potrebbe essere utilizzato per esplorare aspetti del ruolo di epatociti proliferazione e il suo ruolo nel metabolismo e bilancio energetico. La possibilità di avanzamento concettuale in molteplici discipline di ricerca viene migliorato con l&#39;introduzione di questa tecnica. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; In questo lavoro, abbiamo dimostrato le capacità di CFIR per la precisione anatomica di targeting di un fascio di irradiazione focale. Anche se inizialmente abbiamo sviluppato questa piattaforma di ricerca sulle radiazioni di piccoli animali (SARRP) per i nostri studi, altri dispositivi simili sono ora disponibili in commercio che può compiere simili TC guidata irradiazione focale 43, 44. Quindi, generalizziamo questo protocollo CFIR con passaggi necessari per tutte le piattaforme di ricerca piuttosto che quelli specifici per SARRP. I vantaggi di CFIR oltre approcci radiologici precedenti per inibire neurogenesi sono che questa tecnica permette orientamento immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose, la dose conformazionale minimizza l&#39;esposizione di regioni cerebrali nontargeted e geometria della trave alta precisione permette di distribuzione della dose conforme con confini fascio taglienti. Delineiamo come usare l&#39;imaging TC guidata di indirizzare la dose di una regione anatomica specifica e su questo modo, come visualizzare la radiazionedosare la distribuzione direttamente nel tessuto utilizzando colorazione immunoistochimica per γ-H2AX, un marker di DNA a doppio filamento breaks 35, 45-48. L&#39;uso di questo approccio per l&#39;irradiazione selettiva di nicchie neurogena può avere implicazioni significative nel rivelare il ruolo funzionale di nuovi neuroni adulti nati sulla fisiologia e patologia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa. Approcci per inibire neurogenesi adulta tramite consegna virale invasivo o animali transgenici hanno potenziali confonde che rendono l&#39;interpretazione dei risultati di questi studi difficile. Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di indagare in modo non invasivo la funzione di selezionare gruppi di neuroni adulti nati attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti Focal inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni e consente il targeting di specifiche regioni progenitrici neurali. Per illuminare il potenziale ruolo funzionale che la neurogenesi adulta ipotalamico svolge nella regolazione dei processi fisiologici, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti nati nel eminenza mediana dell&#39;ipotalamo. Descriviamo un metodo per C omputer tomografia-guidaf Ocal ir radiazione (CFIR) la consegna per consentire preciso e accurato anatomica di targeting in piccoli animali. CFIR utilizza l&#39;orientamento dell&#39;immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose di radiazione, riduce al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni regioni cerebrali nontargeted, e consente la distribuzione della dose conforme con i confini del fascio taglienti. Questo protocollo permette di porre domande riguardanti la funzione dei neuroni adulti di nascita, ma apre anche le aree a domande nei settori di radiobiologia, biologia dei tumori, e dell&#39;immunologia. Questi strumenti radiologici faciliteranno la traduzione di scoperte al banco al capezzale.

Valutare Targeting CT-guidata e precisione La taratura meccanica del sistema è fondamentale per garantire che travi da varie angolazioni tutti intersecano in un unico punto. Calibrazione è stata eseguita con un metodo di imaging basata semi-automatico, dove end-to-end precisione di allineamento è stato misurato per essere 0,2 millimetri 29. Questa precisione è molto critica come il volume della struttura eminenza mediana ipotalamico è piccolo 2. Per verificare questa ...

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Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un&#39;area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta.

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