Name: functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Vi takker C. Montojo, J. Reyes, og M. Armour for teknisk rådgivning og bistand. Dette arbeidet ble støttet av amerikanske National Institutes of Health stipend F31 NS063550 (til DAL), en Basil O&#39;Connor Starter Scholar Award og stipend fra Klingenstein Fondet og NARSAD (til SB). SB er en WM Keck Distinguished Young Scholar i medisinsk forskning.

Animal Usage Innhente godkjenning fra institusjonelle Animal Care og bruk komité for standard pleie og bruke protokoller. Den nåværende protokollen ble utviklet for fokale bestråling studier på 5,5 til 10 uker gamle C57BL6 voksen / J-mus, som tidligere beskrevet (figur 2) 2. Men andre aldre og små dyrearter (rotter, hamstere, bakken ekorn, osv.) kan også brukes, forutsatt at effektive anestesiprotokoller og en røntgen referanse atlas slik at identifi...

CT-veiledet focal bestråling (CFIR) er en ny og komplett system tilnærming som kan levere strålefelt til mål i små dyr under robot kontroll ved hjelp av CT-veiledning 32. Evnen til CFIR å levere svært fokusert bjelker til små dyremodeller gir nye forskningsmuligheter for å bygge bro laboratorieforskning og klinisk oversettelse. Dette notatet beskriver CFIR tilnærming for presis stråling levering spesifikt mot en hypothalamus nevrale stamceller befolkningen. Vi viser her hvordan du kalibrere og bekr...

Nylige oppdagelser har vist at den voksne hjernen hos pattedyr kan gjennomgå en bemerkelsesverdig grad av plastisitet. Voksen fødte nevroner genereres gjennom hele voksenlivet i spesialiserte nisjer av pattedyrhjernen en. Hva er funksjonen til disse voksne fødte nevroner? Og mer så, de spiller en rolle i fysiologi og atferd? Studier på dette området har tradisjonelt fokusert på subventricular sone av den laterale ventriklene og subgranular sonen av hippocampus, men nyere studier har preget neurogenesis i andre områder av hjernen som for eksempel pattedyr hypothalamus to. Neurogenesis har blitt rapportert i barsel og voksen hypothalamus 2-10, og funksjonen til disse nyfødte hypothalamus nevroner er fortsatt et aktivt område på etterforskningen. Den funksjonelle karakterisering av voksen-født nevroner er fortsatt en betydelig utfordring for nevrovitenskap feltet generelt. Selektiv hemming av specific nevrale stamceller bestander er fortsatt begrenset av mangel på tilgjengelige molekylære markører som er unike for enkelt nevrale stamceller populasjoner 11. Dermed selektiv sletting av voksne fødte nevroner fra disse nevrale stamceller via genetisk målretting er fortsatt vanskelig. Likeledes, lider viral levering å målrette voksen fødte nevroner fra potensielle konfunderende variabler som innføre skade og betennelse i miljøet 12. Nye radiologiske verktøy dukker opp, men som tillater en å omgå disse confounds og undersøke disse spørsmålene gjennom nøyaktig og presis anatomisk målretting i små dyr. Ioniserende stråling hemmer fødselen og differensiering av nye nerveceller, og gjør at en ikke-invasiv metode for å målrette nevrale stamceller populasjoner 13-15. Nylig har vi beskrevet en germinal region av pattedyr hypothalamus median eminense (ME) som vi kalte hypothalamus proliferativ sone (HPZ) 2 </sup&gt;. Vi fant ut at når unge voksne hunnmus ble gitt en fettrik diett (HFD), nivåer av neurogenesis i HFD-matet mus var vesentlig høyere enn normal chow (NC) matet kontroller i dette ME region 2. For å teste om voksen neurogenesis innenfor hypothalamus ME regulerer stoffskiftet og vekt, forsøkte vi å forstyrre denne prosessen. Median dominans er en liten unilateral struktur på bunnen av den tredje ventrikkel for regulatoriske hormoner frigjøres. For å hindre spredning og påfølgende neurogenesis uten å endre de andre fysiologiske funksjoner i denne hjernen regionen, har vi utviklet en ikke-invasiv brennvidde bestråling teknikk for å selektivt hemme fødselen av nyfødte voksne nevroner i hypothalamus median eminense to. En rekke grupper har ansatt stråling for å undertrykke neurogenesis i kanoniske regioner 14-28. Imidlertid har tidligere radiologiske tilnærminger generelt målrettet store områder, eller Often utilsiktet også rettet flere hjerneområder hvor neurogenesis har blitt rapportert, noe som gjør det vanskelig å entydig knytte eventuelle atferds defekter observert med defekter i spesifikke nevrale stamceller populasjoner. Muligheten for mer målrettet bestråling er levert av radiologiske plattformer som kombinerer c omputer tomografi styrt bildebehandling med f ocal bjelke ir stråling (CFIR) levering for å muliggjøre presis anatomisk målgruppe 29-36. Stråling bjelker så små som 0,5 mm i diameter er tilgjengelige for å målrette spesifikke nevrale stamceller populasjoner 35. Denne metoden gjør det mulig for oss å målrette hypothalamus ME og arrestere spredning og blokkere neurogenesis i små dyr. Etter radiologisk behandling på følgende progenitor populasjoner, kan fysiologiske og atferdsmessige tester utføres for å belyse potensialet funksjon av voksen-fødte celler. Focal målretting er spesielt viktig for vår søknad sidenhypofysen ligger nær hypothalamus median eminense, bestråling av hypofysen kan påvirke hormonelle funksjon og senere forvirre resultater. Det biologiske grunnlaget for undertrykkelse av neurogenesis etter bestråling er fremdeles uklart. Tidligere stråling studier har stolt på store bjelker i området, og har konkludert med at undertrykkelsen av neurogenesis gjennom en inflammatorisk respons 14, 37 er mediert. Som sådan er det uklart om svært focal bestråling kunne undertrykke neurogenesis, siden den ikke fremkalle en betydelig inflammatorisk respons. Imidlertid har nyere studier av vår gruppe av den klassiske nevrogen regionen i hippocampus viste at svært focal bestråling med en dose på 10 Gy kan undertrykke neurogenesis i minst fire uker etter bestråling 35. Å avhøre funksjonen av voksne fødte hypothalamus nevroner i median eminense, bruker vi en presisjon stråling device stand til å levere CT-avbildning i kombinasjon med liten diameter stråling bjelker for å hemme ME neurogenesis. Ved hjelp av et røntgen-rør festet til en portalkraner som roterer over et område på 360 °, vi leverer bue-formede mikro bestrålingsstråle med bruk av en robotstyrt prøvetrinn som tillater rotasjon av et dyr gjenstand under strålebehandling (figur 1) . En høy oppløsning røntgendetektor anvendes for å skaffe bilder når portalen er i den horisontale stilling 33. For denne studien, ble CT-bilder rekonstruert med en isotrop voxel størrelse på 0,20 mm. CT-avbildning Bygde tillot identifikasjon av et mål samtidig som dyret er i behandlingsposisjonen. Målet ble lokalisert ved hjelp av CT navigasjon dose-planlegging programvare, som ble levert med våre kommersielt tilgjengelig radiologisk plattform. Etter å lokalisere avkastningen med CT-avbildning ble dyret beveget seg til den aktuelle behandlingsposisjon ved robotprøvetrinn som har fire graderRees frihets (X, Y, Z, θ). Gjennom en kombinasjon av portalkraner og robot stadium vinkler, kan bjelkene bli levert fra nesten hvilken som helst retning i forhold til dyret, og stereotaktisk lysbue-lignende behandlinger er mulig 29. For disse og alle andre avbildningsstudier ble musene plassert i en immobilisering enhet som tillater levering av isofluran anestesi gass mens begrense bevegelse. Immobilisering seng er CT-kompatibel, og kobles til robotprøvestadiet 34. Vi forventer at CFIR vil gi konseptuelle fremskritt i en rekke forskningsområder. Selv om vi bruker radiologisk målretting av hypothalamus median eminense som bevis på prinsippet om denne teknikken, kan CFIR brukes til å målrette en region av kroppen av alle små modellorganisme i prinsippet. I nevrovitenskap, for eksempel, ser vi for oss denne teknikken kan brukes til å vurdere funksjonen til aktivt proliferative progenitor populasjoner som har blitt foreslått å eksist i andre circumventricular organer, slik som i området postrema 38, 39, subfornical organ 40, og hypofysen 41.. Langvarige kontroverser om den funksjonelle rollen til voksen neurogenesis og identifisere en kausal rolle i atferd kan også nå bli bedre ivaretatt. I sangfuglen, kan denne teknikken ta rollen som voksen neurogenesis i å opprettholde robuste og sesong oppførsel av fuglesang 42, som har vært hemmet av muligheten til å selektivt hemme neurogenesis i bestemte områder av hjernen. Forstå dette robust atferdsmodellen, kan kaste nytt innsikt i rollen som voksen neurogenesis i å regulere andre seksuelt dimorfe atferd. Alternativt, i den metabolske feltet, CFIR kan brukes til å utforske sider ved den rollen hepatocytter spredning og dens rolle i stoffskiftet og energibalansen. Muligheten for konseptuelle forhånd i flere forskningsdisipliner er forbedret med introduksjonen av denne teknikken. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; I denne artikkelen, vi vise mulighetene CFIR for presisjon anatomiske målretting av et fokus bestråling bjelke. Selv om vi i utgangspunktet utviklet denne lille dyret stråling forskningsplattform (SARRP) for våre studier, andre lignende enheter er nå kommersielt tilgjengelig som kan utføre tilsvarende CT-veiledet focal bestråling 43, 44. Derfor generaliserer vi denne CFIR protokollen med trinn som kreves for alle forskningsplattformer snarere enn de som spesifikt for SARRP. Fordelene med CFIR enn tidligere radiologiske metoder for å hemme neurogenesis er at denne teknikken gir tredimensjonal volumet image veiledning for lokalisering og målretting av dosen, minimerer konforme dose eksponering for nontargeted områder av hjernen, og høy presisjon bjelke geometri tillater konforme dose distribusjon med skarpe bjelke grenser. Vi skissere hvordan å bruke CT-veiledet bildebehandling for å målrette dosen til et bestemt anatomisk region, og når du gjør det, hvordan å visualisere strålingdose distribusjon direkte i vevet ved hjelp av immunhistokjemisk farging for γ-H2AX, en markør av DNA dobbel-strandet pauser 35, 45-48. Bruken av denne tilnærmingen for selektiv bestråling av nevrogene nisjer kan ha betydelige implikasjoner i å avsløre den funksjonelle rollen til nye voksne fødte nevroner på fysiologi og sykdom.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

Den funksjonelle karakterisering av voksen-født nevroner er fortsatt en betydelig utfordring. Tilnærminger for å hemme voksen neurogenesis via invasiv viral levering eller transgene dyr har potensielle confounds som gjør tolkningen av resultatene fra disse studiene vanskelig. Nye radiologiske verktøy dukker opp, men som tillater en å invasivt undersøke funksjonen av utvalgte grupper av voksne fødte nevroner gjennom nøyaktig og presis anatomisk målretting i små dyr. Focal ioniserende stråling hemmer fødselen og differensiering av nye nerveceller, og tillater målretting av spesifikke nevrale stamceller regioner. For å belyse potensialet funksjonell rolle som voksen hypothalamus neurogenesis spiller i reguleringen av fysiologiske prosesser, har vi utviklet en ikke-invasiv brennvidde bestråling teknikk for å selektivt hemme fødselen av voksne fødte nevroner i hypothalamus median eminense. Vi beskriver en fremgangsmåte for C omputer tomografi-ledetf ocal ir stråling (CFIR) levering for å muliggjøre presis og nøyaktig anatomisk målretting i små dyr. CFIR bruker tredimensjonale volumet image veiledning for lokalisering og målretting av stråledosen, reduserer stråling til nontargeted områder av hjernen, og gjør det mulig for konforme dose distribusjon med skarpe strålegrenser. Denne protokollen gjør det mulig å stille spørsmål angående funksjon av voksne fødte nevroner, men åpner også områder til spørsmål knyttet til strålebiologi, tumorbiologi og immunologi. Disse radiologiske verktøy vil forenkle oversettelsen av funn på benken til sengen.

Vurdere CT-veiledet målretting og nøyaktighet Den mekaniske kalibrering av systemet er kritisk for å sikre at strålene fra ulike vinkler alle skjærer hverandre i et enkelt punkt. Kalibrering ble utført med en halv-automatisk avbildnings-baserte metode, hvor ende-til-ende-justeringsnøyaktighet har blitt målt til å være 0,2 mm 29. Denne nøyaktigheten er sterkt kritisk som volumet av hypothalamus median dominans struktur er lite 2.. For å teste denne kalibreringen...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Funksjonen av voksen-fødte pattedyr nevroner er fortsatt et aktivt område på etterforskningen. Ioniserende stråling hemmer fødselen av nye nerveceller. Ved hjelp av computer tomografi styrt fokus bestråling (CFIR), kan tredimensjonal anatomisk målretting av spesifikke nevrale stamceller populasjoner nå brukes til å vurdere den funksjonelle rollen som voksen neurogenesis.

Funksjonell Avhør av Adult Hypothalamus Neurogenesis med Focal Radiologisk Hemming

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Metoder for Modulation og analyse av NF-κB-avhengig Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funksjonell Imaging av auditive cortex hos voksne katter ved hjelp av høy-feltet fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stab Wound Skade av sebrafisk Adult Telencephalon: En metode for å etterforske Virveldyr Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-foton Intracellulær Sodium Imaging Kombinert med UV-mediert Focal Uncaging av Glutamat i CA1 Pyramideformet Neuroner

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunhistokjemi og Multiple merking med antistoffer fra samme vert Arter å studere Voksen hippocampus Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Vurdere Primær Neurogenesis i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoet Bruke Farging

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

Online Transkraniell magnetisk stimulering protokollen for å måle kortikale fysiologi tilknyttet svar hemming

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...