Name: functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00
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Damos las gracias a C. Montojo, J. Reyes y M. Armadura de asesoramiento y asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de subvención F31 NS063550 (a DAL), un premio Basil O&#39;Connor arranque Académico y subvenciones del Fondo Klingenstein y NARSAD (a SB). SB es un WM Keck Distinguido Académico Joven en la investigación médica.

Uso de los Animales Obtener la aprobación del Comité de Cuidado de Animales y el empleo institucional de los protocolos de atención y de uso estándar. El protocolo actual fue desarrollado para estudios de irradiación focales sobre 5.5-10 semanas de edad adultos ratones C57BL6 / J, como se describió previamente (Figura 2) 2. Sin embargo, otras edades y especies de pequeños animales (ratas, hamsters, ardillas de tierra, etc) también pueden utilizarse, ...

La irradiación focal guiada por tomografía computarizada (CFIR) es un enfoque novedoso y completo sistema capaz de entregar los campos de radiación a los objetivos en pequeños animales bajo control robótico utilizando CT-guía 32. La capacidad de CFIR para que emita haces altamente enfocados a los pequeños modelos animales proporciona nuevas oportunidades de investigación para colmar la investigación de laboratorio y la traducción clínica. En este trabajo se describe el enfoque CFIR para la entrega ...

Descubrimientos recientes han demostrado que el cerebro adulto de mamíferos puede someterse a un notable grado de plasticidad. Neuronas adultas nacidas se generan durante la edad adulta en nichos especializados del cerebro de los mamíferos 1. ¿Cuál es la función de estas neuronas adultas nacidas? Y más aún, es lo que desempeñan un papel en la fisiología y el comportamiento? Los estudios sobre este tema se han centrado tradicionalmente en la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular del hipocampo, sin embargo, estudios recientes han caracterizado la neurogénesis en otras regiones del cerebro tales como el hipotálamo 2 de mamífero. La neurogénesis se ha informado en el posnatal y el hipotálamo adulto 2-10, y la función de estas neuronas hipotalámicas recién nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante para el campo de la neurociencia en general. La inhibición selectiva de especificaciónific poblaciones progenitoras neurales sigue siendo limitada por la falta de marcadores moleculares disponibles que son exclusivos de las poblaciones progenitoras neuronales individuales 11. Por lo tanto, la eliminación selectiva de las neuronas adultas nacidas de estos progenitores neurales a través de modificación genética dirigida sigue siendo difícil. Del mismo modo, la entrega viral para apuntar neuronas adultos nacidos sufre de posibles variables de confusión tales como la introducción de la lesión y la inflamación en el medio ambiente 12. Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno evitar estos factores de confusión e investigar estas preguntas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante inhibe el nacimiento y la diferenciación de nuevas neuronas, y permite que un método no invasivo para apuntar las poblaciones progenitoras neurales 13-15. Recientemente, hemos descrito una región germinal de la eminencia media del hipotálamo de los mamíferos (ME) que hemos llamado la zona proliferativa hipotalámico (HPZ) 2 </sup&gt;. Hemos encontrado que cuando los jóvenes ratones hembras adultas se les dio una dieta alta en grasas (HFD), los niveles de neurogénesis en ratones alimentados con HFD eran sustancialmente más alto que su pienso normal (NC) controles alimentados en esta región ME 2. Para probar si la neurogénesis adulta en el ME hipotálamo regula el metabolismo y el peso, se trató de interrumpir este proceso. La eminencia media es una pequeña estructura unilateral en la base del tercer ventrículo a partir del cual se liberan hormonas reguladoras. Con el fin de inhibir la proliferación y posterior neurogénesis sin alterar las otras funciones fisiológicas de esta región del cerebro, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas recién nacidos en la eminencia media del hipotálamo 2. Un número de grupos han empleado la radiación para suprimir la neurogénesis en regiones canónicas 14-28. Sin embargo, los enfoques radiológicos anteriores generalmente se han centrado en grandes áreas, o often involuntariamente también dirigido múltiples áreas del cerebro donde se ha reportado la neurogénesis, por lo que es difícil asociar de forma inequívoca los defectos de comportamiento observados con defectos en poblaciones específicas progenitoras neurales. La capacidad de irradiación más específico es proporcionado por plataformas radiológicos que combinan omputer imagen guiada por tomografía con c f ocal radiación rayos IR (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa orientación 29-36. Rayos de la radiación tan pequeñas como de 0,5 mm de diámetro están disponibles para dirigirse a poblaciones progenitoras neurales específicas 35. Esta metodología nos permite apuntar el ME hipotálamo y detener la proliferación y el bloque de la neurogénesis en animales pequeños. Después del tratamiento radiológico en estas poblaciones progenitoras, pruebas fisiológicas y de comportamiento se pueden realizar para iluminar la función potencial de las células adultos nacidos. Focalización focal es especialmente importante para nuestra aplicación, ya que elglándula pituitaria está situada cerca de la eminencia media del hipotálamo; irradiación de la hipófisis puede afectar la función hormonal y posteriormente confundir los resultados. La base biológica para la supresión de la neurogénesis después de la irradiación sigue siendo poco clara. Estudios de radiación previos se han basado en grandes vigas de la zona, y han llegado a la conclusión de que la supresión de la neurogénesis está mediada a través de una respuesta inflamatoria 14, 37. Como tal, no está claro si la irradiación altamente focal podría suprimir la neurogénesis, ya que no provoca una respuesta inflamatoria sustancial. Sin embargo, estudios recientes realizados por nuestro grupo de la región clásico neurogénica en el hipocampo han demostrado que la irradiación altamente focal con una dosis de 10 Gy puede suprimir la neurogénesis durante al menos 4 semanas después de la irradiación 35. Para interrogar a la función de las neuronas hipotalámicas adultos nacidos en la eminencia media, se utiliza una radiación de precisión device capaz de entregar imágenes de TC en combinación con haces de radiación de pequeño diámetro para inhibir ME neurogénesis. El uso de un tubo de rayos X unido a un pórtico que gira sobre un rango de 360 °, ofrecemos arco de haz del haz de micro irradiación con el uso de una etapa espécimen controlado robóticamente que permite la rotación de un sujeto animal durante el tratamiento de radiación (Figura 1) . Un detector de rayos X de alta resolución se utiliza para adquirir imágenes cuando el pórtico se encuentra en la posición horizontal 33. Para este estudio, las imágenes de TC fueron reconstruidos con un tamaño de voxel isotrópico de 0,20 mm. De imágenes de a bordo CT permitió la identificación de un objetivo, mientras que el animal está en la posición de tratamiento. El objetivo fue localizado mediante el software de planificación de la dosis de navegación CT, que estaba incluido en nuestra plataforma radiológica disponible en el mercado. Después de la localización de nuestro ROI por la TC, el animal se mueve a la posición de tratamiento apropiado por la platina robótico que tiene cuatro gradosrees de libertad (X, Y, Z, θ). A través de una combinación de ángulos de pórtico y de la etapa de robot, las vigas pueden ser entregados desde casi cualquier dirección con respecto al animal, y tratamientos de arco estereotácticas son posibles 29. Para estos y todos los otros estudios de imágenes, los ratones fueron colocados en un dispositivo de inmovilización que permite el suministro de gas isoflurano anestésico mientras se restringe el movimiento. La cama inmovilización es compatible CT, y se conecta a la platina robótico 34. Esperamos que CFIR proporcionará avances conceptuales en una serie de áreas de investigación. A pesar de que utiliza la orientación radiológica de la eminencia mediana del hipotálamo como prueba de principio de esta técnica, CFIR se puede utilizar para dirigirse a cualquier región del cuerpo de cualquier organismo modelo pequeño, en principio. En las neurociencias, por ejemplo, prevemos esta técnica podría utilizarse para evaluar la función de las poblaciones progenitoras activamente proliferativas que se ha sugerido que exist en otros órganos circumventricular, tales como el área postrema 38, 39, órgano subfornical 40, y la pituitaria 41. Controversias de larga data en cuanto al papel funcional de la neurogénesis adulta y la identificación de un papel causal en el comportamiento pueden ahora ser mejor atendidos. En cantante, esta técnica podría abordar el papel de la neurogénesis adulta en el mantenimiento de el comportamiento robusto y estacional de canto de los pájaros 42, que ha sido obstaculizado por la capacidad de inhibir selectivamente la neurogénesis en regiones específicas del cerebro. La comprensión de este modelo de comportamiento robusto podría arrojar nueva luz sobre el papel de la neurogénesis adulta en la regulación de otras conductas de dimorfismo sexual. Alternativamente, en el campo metabólico, CFIR podría ser utilizado para explorar aspectos de la función de la proliferación de hepatocitos y su papel en el metabolismo y el balance energético. La posibilidad de que avance conceptual en múltiples disciplinas de investigación se ve reforzada por la introducción de esta técnica. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; En este trabajo se demuestra la capacidad de CFIR para anatómica precisión la orientación de un haz de irradiación focal. A pesar de que inicialmente desarrollado esta plataforma de investigación de la radiación de pequeños animales (SARRP) para nuestros estudios, otros dispositivos similares están ahora disponibles comercialmente que puede lograr la irradiación similares guiada por TC focal 43, 44. Por lo tanto, se generaliza este protocolo CFIR con los pasos necesarios para todas las plataformas de investigación en lugar de los que son específicos para SARRP. Las ventajas de CFIR más de los enfoques radiológicos anteriores para inhibir la neurogénesis son que esta técnica permite la orientación de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis, la dosis de conformación minimiza la exposición a regiones del cerebro no focalizados, y la geometría del haz de alta precisión permite una distribución de dosis conforme con límites haz afilados. Planteamos cómo utilizar imágenes guiada por TC para apuntar la dosis a una región anatómica específica, y al hacerlo, la forma de visualizar la radiaciónDistribución de la dosis directamente en el tejido mediante la tinción inmunohistoquímica para γ-H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de DNA 35, 45-48. El uso de este enfoque para la irradiación selectiva de nichos neurogénicos puede tener implicaciones significativas en cuanto a revelar el papel funcional de las nuevas neuronas adultas nacidas en la fisiología y la enfermedad.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante. Enfoques para inhibir la neurogénesis adulta a través de la entrega viral invasivo o animales transgénicos tienen potenciales factores de confusión que hacen que la interpretación de los resultados de estos estudios sean difíciles. Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno investigar de forma no invasiva la función de grupos selectos de las neuronas adultas nacidas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante focal inhibe el nacimiento y la diferenciación de neuronas nuevas, y permite la orientación de las regiones específicas progenitoras neurales. Con el fin de iluminar el papel funcional potencial que la neurogénesis adulta hipotálamo desempeña en la regulación de procesos fisiológicos, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas nacidas en la eminencia media del hipotálamo. Se describe un método para C omputer guiada por tomografíaf ocal ir radiación (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa y exacta orientación en pequeños animales. CFIR utiliza guía de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis de radiación, minimiza la exposición a la radiación de las regiones del cerebro no focalizados, y permite la distribución de la dosis de conformación de haz con límites afilados. Este protocolo permite a uno a preguntarse cuestiones relativas a la función de las neuronas adultos nacidos, sino que también abre las áreas a las preguntas en las áreas de la radiobiología, la biología del tumor, y la inmunología. Estas herramientas radiológicas facilitará la traslación de los descubrimientos en el laboratorio a la cabecera del paciente.

Evaluar Targeting guiada por TC y Precisión La calibración mecánica del sistema es crítica para asegurar que los haces de todos los varios ángulos se cruzan en un solo punto. La calibración se lleva a cabo con un método basado en la formación de imágenes semiautomático, donde la precisión de alineación de extremo a extremo se ha medido para ser de 0,2 mm 29. Esta precisión es muy crítico como el volumen de la estructura de la eminencia mediana del hipotálamo es pequeñ...

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Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

La función de las neuronas de mamíferos adultos nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La radiación ionizante inhibe el nacimiento de nuevas neuronas. Usando el ordenador guiada por tomografía irradiación focal (CFIR), la orientación anatómica tridimensional de poblaciones específicas progenitoras neurales ahora se puede utilizar para evaluar el papel funcional de la neurogénesis adulta.

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