Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Drs Karl-Heinz Krause og Vincent Jaquet for hjælp og rådgivning til at etablere disse protokoller, og takker også Christoph Bauer og Jérôme Bosset fra Bioimaging Platform for NCCR og Dr. Navin Gopaldass for deres tekniske support. Forskningen er støttet af en ProDoc tildeling af den schweiziske National Science Foundation.

1.. Visualisering og Kvalitativ måling af ROS Produktion i Phagosomes De OBG-belagte kugler bør være forberedt på forhånd. De perler overtrækningsprocedurer og agaroverlejring teknik er tilpasset fra offentliggjorte referencer 5,14. <ol><li> Tilsæt 1 ml suspension af 3,0 mM carboxylerede silicaperler (ca. 1,8 x 10 9 perler) i et 1,5 ml rør, vaske perlerne 3x med 1 ml PBS ved hurtig spin og vortex. </li><li> Resuspendere perlerne i 1 ml PBS indeholdende 25 mg /...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Sammenlignet med de tidligere beskrevne fremgangsmåder, OGB assayet dynamisk visualiserer processen phagosomal ROS-generering på enkelt celle niveau, i stedet for at måle en gennemsnitlig ROS signal fra en population af celler. Sådanne befolkning-gennemsnitsperioder metoder tendens til at tilsløre vigtige oplysninger forårsaget af asynkrone fagocytose. Vi har med held tilpasset DHE og AUR assays til Dictyostelium og optimeret protokollerne. Vigtigst er det, vi specificerede typer og subcellulære lokalise...

Reaktive oxygenarter (ROS) er involveret i en lang række biologiske processer, såsom værtsforsvar signalering, væv udvikling og respons på skade samt forhøjet blodtryk og cancer. Den velundersøgte phagosomal NADPH oxidase maskiner er dedikeret til hurtig ROS generation, der er kendt som den oxidative burst, til at dræbe bakterier indtages i neutrofiler &#39;phagosomes 1. Desuden blev lækage af elektroner som et biprodukt af mitokondrie respiratoriske kæde tidligere troede at kun ansvarlig for en ureguleret kilde af ROS. Men for nylig blev det identificeret som en vigtig mekanisme til at bidrage til intraphagosomal drab af bakterier i musemakrofager 2. I de senere år har den sociale amøbe, Dictyostelium, bliver en magtfuld og populær model til at studere celle iboende mekanismer i medfødt immunrespons. Faktisk Dictyostelium og menneskelige fagocytter deler et overraskende højt niveau af beskyttelse i molecular machineries ansvarlige for bakterier sensing, engulfment og dræbte 3,4. De homologer af proteiner og enzymer i forbindelse med produktionen af ROS eller afgiftning såsom NADPH oxidaser, katalaser, superoxid dismutases, kan findes i både human-og Dictyostelium. Som bedst undersøgte amøber Dictyostelium præsenterer flere unikke fordele i forhold til pattedyr-modelsystem. De vokser ved stuetemperatur uden behov for CO 2, med en fordoblingstid på 8-10 timer. De kan nemt holdes som adhærente eller suspensionskulturer. Hertil kommer, takket være deres fuldt sekventeret og kommenteret haploidgenom, samt til nem genetisk manipulation har Dictyostelium blive et meget attraktivt eksperimentel model organisme. I tidligere undersøgelser, forskellige chlorerede og fluorerede derivater af fluorescein (kollektivt kendt som OxyBurst Green, OGB) der udsender fluorescens efter oxidation af ROS, er blevet anvendt som en ROS reporter. Celle-permeant esterified derivater bruges til at måle cytoplasmatisk ROS, mens celle-impermeabel dextran-eller protein-koblede derivater bruges til at måle ekstracellulære ROS. Navnlig har OGB BSA-belagte kugler allerede blevet anvendt til at påvise phagosomal produktionen af ROS i pattedyrceller 5. Imidlertid kan mikropladelæseren tilgang kun give et gennemsnit ROS-generering kurven fra en population af celler. Med den nuværende protokol, ved hjælp af Dictyostelium, en professionel phagocyt og optimerede eksperimentelle betingelser, vi får en stabil og effektiv fagocytose uden conjugating nogen opsonin på perlerne. DHE har været anvendt i forskellige modelsystemer, såsom pattedyr neutrofiler og makrofager, for at påvise produktionen af ROS 6-9. I mellemtiden er der nogle kontroverser over specificitet og sensitivitet af metoden 8,10. Som en forbedret version af Amplex Red, fluorescensintensitet AUR er mindre følsomme over for pH-værdi, hvilket gør det mere egnet til at måleROS i ikke-neutrale eller svagt sure miljøer. AUR er for nylig blevet anvendt i flere pattedyrsystemer 11,12, men er ikke blevet rapporteret endnu dens anvendelse i nonmammalian modeller, som ofte kræver svagt surt vækstmedier,. Desuden er der ingen offentliggjorte protokol til kvantitativt og dynamisk måle ROS produktion og lokalisering i den sociale amøbe Dictyostelium. Målet med den præsenterede sæt af protokoller er at give en nem og alsidig løsning til at overvåge forskellige ROS og deres lokalisering, og yderligere giver indsigt i ROS-relaterede cellulære mekanismer. For OBG analysen, brugte vi levende mikroskopi til at overvåge hele processen med phagosomal ROS generation efter optagelse af OBG-belagte kugler fra Dictyostelium celler og tilvejebragt en ny tilgang til at studere den mekanisme af intraphagosomal drab af bakterier. Vi har optimeret medium-throughput DHE og AUR assays i Dictyostelium at måle intracellulær Superoxide og ekstracellulære H 2 O 2-produktion, henholdsvis ved hjælp af LPS som en potent ROS stimulator. Bemærk, at LPS blev for nylig vist at forøge den baktericide aktivitet af Dictyostelium fremad fagocyteres bakterier 13. Desuden behandling med DEDTC og katalase udtrykkeligt bekræftet, at disse to metoder, der specifikt måler forskellige typer og subcellulære lokaliseringer af realkreditobligationer i Dictyostelium. Endelig kan OGB assay tilpasset vedhængende fagocytisk celle, ved yderligere opsoniserende perlerne med ligander for fagocytiske receptorer af dyreceller. I princippet kan DHE og AUR assays også finjusteres til målinger i vedhængende eller nonadhærente celle under passende eksperimentelle betingelser.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Reaktive ilt arter (ROS) omfatter en række af reaktive og kortlivede, oxygenholdige molekyler, som er dynamisk interkonverterede eller elimineres enten katalytisk eller spontant. På grund af de korte levetid af de fleste ROS og mangfoldigheden af ​​deres kilder og subcellulære lokaliseringer kan et komplet billede kun opnås ved omhyggelige målinger ved hjælp af en kombination af protokoller. Her præsenterer vi et sæt af tre forskellige protokoller hjælp OxyBurst Grøn (OBG)-coatede perler eller dihydroethidium (DHE) og Amplex UltraRed (AUR), kvalitativt og kvantitativt at overvåge forskellige ROS i professionelle fagocytter såsom Dictyostelium. Vi optimeret perler belægning procedurer og brugte OBG-belagte kugler og levende mikroskopi til dynamisk visualisere intraphagosomal ROS generation på enkelt celle niveau. Vi identificerede lipopolysaccharid (LPS) fra E. coli som en potent stimulator for ROS generation i Dictyostelium. Desuden har vi developed realtid, medium-throughput analyser anvender DHE og AUR til kvantitativ måling af intracellulær superoxid og ekstracellulær H 2 O 2 produktion, hhv.

Den generation af ROS i phagosomes kan visualiseres kvalitativt og dynamisk ved mikroskopi (File S1). Den røde fluorescens, der udsendes af Alexa Fluor 594 er pH-ufølsom og forbliver konstant i phagosomal miljø, mens oxidation af OBG øger sin fluorescens i den grønne kanal. Emissionsspektret af in vitro-oxideret og nonoxidized OGB-belagte kugler er sammenlignet i figur 1B, der viser en betydelig stigning i intensitet efter oxidation. For at lette visualisering af live-begi...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Vi tilpasset et sæt protokoller til måling af reaktive ilt arter (ROS), som kan anvendes i forskellige amøber og pattedyrs cellulære modeller for kvalitative og kvantitative undersøgelser.

Afsløring, visualisere og kvantificering af generation af reaktive ilt arter i en amøbe Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Produktion, oprensning og karakterisering af Cell-invasive DISC1 proteinarter

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generering af mærket og Markerless Mutanter i Model cyanobakteriel Arter

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Rodent Working Heart Model for Studiet af Myokardie Ydelse og iltforbrug

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Visualisere de tidlige stadier af Fagocytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering af en ekstracellulære sure pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...