Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

We zijn dankbaar voor Drs Karl-Heinz Krause en Vincent Jaquet voor hulp en advies voor het opzetten van deze protocollen, en ook dank Christoph Bauer en Jerôme Bosset uit de Bioimaging Platform van het NCCR en Dr Navin Gopaldass voor hun technische ondersteuning. Het onderzoek wordt ondersteund door een Prodoc toekenning van de Zwitserse National Science Foundation.

1. Visualisatie en kwalitatieve meting van ROS productie in fagosomen De OBG-gecoate kralen moeten worden voorbereid op voorhand. De kralen coating procedures en agar overlay techniek worden aangepast uit gepubliceerde referenties 5,14. <ol><li> Voeg 1 ml suspensie van 3,0 urn gecarboxyleerde silicapareltjes (ongeveer 1,8 x 10 9 kralen) in een 1,5 ml buis, was de kralen 3x met 1 ml PBS met snelle rotatie en vortexen. </li><li> Resuspendeer de kralen in 1 ml PBS dat 25...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Vergeleken met de eerder beschreven werkwijzen, OBG test dynamisch visualiseert de werkwijze phagosomal ROS generatie op enkele cel, in plaats van het meten van een gemiddelde ROS signaal van een populatie cellen. Dergelijke populatie-gemiddelde methoden zijn vaak kritische informatie veroorzaakt door nonsynchronous fagocytose verduisteren. Wij hebben met succes DHE en AUR assays aangepast aan Dictyosteliumcellen en geoptimaliseerd de protocollen. Belangrijker nog, we aangegeven de soorten en de subcellulaire l...

Reactieve zuurstof species (ROS) zijn betrokken bij vele verschillende biologische processen zoals afweer, signalering, weefselontwikkeling en reactie op letsel en hypertensie en kanker. De goed bestudeerde phagosomal NADPH oxidase machines is gewijd aan snelle ROS generatie, bekend als de oxidatieve burst, om bacteriën ingenomen in phagosomes neutrofielen &#39;1 doden. Bovendien werd lekkage van elektronen als een bijproduct van de mitochondriale ademhalingsketen eerder gedacht alleen verantwoordelijk voor een ongereguleerde bron van ROS zijn. Maar onlangs werd geïdentificeerd als een belangrijk mechanisme bijdragen aan intraphagosomal doden van bacteriën in muizen macrofagen 2. In de afgelopen jaren, heeft de sociale amoebe, Dictyosteliumcellen, uitgegroeid tot een krachtige en populaire model naar cel intrinsieke mechanismen van de aangeboren immuunrespons bestuderen. Inderdaad, Dictyostelium en menselijke fagocyten delen een verrassend hoog niveau van instandhouding in molecular machines die verantwoordelijk zijn voor bacteriën sensing, afblazen en het doden van 3,4. De homologen van de eiwitten en enzymen betrekking tot ROS productie of detoxificatie, zoals NADPH oxidase, katalase, superoxide dismutase, kan worden gevonden in menselijke en Dictyostelium. Zoals de best bestudeerde amoebe, Dictyostelium presenteert een aantal unieke voordelen ten opzichte van zoogdieren modelsysteem. Ze groeien bij kamertemperatuur zonder de noodzaak van CO2 met een verdubbelingstijd van 8-10 uur. Ze kunnen gemakkelijk worden bewaard als hechtende of opschorting culturen. Bovendien, dankzij hun volledig gesequenced en geannoteerd haploïde genoom, en gemakkelijk genetische manipulatie, Dictyosteliumcellen is uitgegroeid tot een zeer aantrekkelijke experimenteel model organisme. In vorige studies, verschillende gechloreerde en gefluoreerde derivaten van fluoresceïne (gezamenlijk bekend als OxyBurst Green, OBG) die fluorescentie uitzenden na oxidatie door ROS, zijn gebruikt als ROS reporter. Cel-doordringende esterified derivaten worden gebruikt om cytoplasmatische ROS te meten, terwijl cel-impermeant dextran-of-eiwit-gekoppelde derivaten worden gebruikt om extracellulaire ROS te meten. Met name OBG BSA-beklede parels reeds gebruikt phagosomal ROS productie detecteren in zoogdiercellen 5. Echter, de microplaat-lezer aanpak geven slechts een gemiddelde ROS generatie curve uit een populatie van cellen. Met het huidige protocol, met behulp Dictyosteliumcellen, een professioneel fagocyt, en geoptimaliseerd experimentele omstandigheden, stabiel en efficiënt fagocytose krijgen we zonder het vervoegen enige opsonine op de parels. DHE is gebruikt in verschillende modelsystemen, zoals zoogdieren neutrofielen en macrofagen, de productie van ROS 6-9 detecteren. Inmiddels zijn er enkele controverse over de specificiteit en gevoeligheid van de methode 8,10. Een verbeterde versie van Amplex Red, de fluorescentie-intensiteit van AUR minder gevoelig voor pH, waardoor het geschikt is om te meten maaktROS in nonneutral of zwak zure milieus. AUR is onlangs toegepast op verschillende zoogdiersystemen 11,12, maar het gebruik ervan in nonmammalian modellen, die vaak nodig zwak zure groeimedia, nog niet gerapporteerd. Daarnaast is er geen gepubliceerde protocol om kwantitatief en dynamisch meten ROS productie en lokalisatie in de sociale amoebe Dictyostelium. Het doel van de gepresenteerde set protocollen is om een ​​gemakkelijke en veelzijdige oplossing te controleren verschillende ROS en hun lokalisatie, en verder geven inzicht in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen. Voor de OBG test gebruikte we live microscopie om het hele proces van phagosomal ROS generatie na opname van OBG-gecoate kralen door Dictyosteliumcellen cellen bewaken, en voorzien van een nieuwe benadering van het mechanisme van intraphagosomal doden van bacteriën te bestuderen. We hebben midden-throughput DHE en AUR assays geoptimaliseerd Dictyostelium, intracellulaire Superox metenide en extracellulaire H 2 O 2 productie, respectievelijk door LPS als een krachtige stimulator ROS. Merk op dat LPS onlangs werd aangetoond dat de bactericide activiteit van Dictyosteliumcellen richting gefagocyteerd bacteriën 13 te verhogen. Daarnaast is de behandeling met DEDTC en catalase uitdrukkelijk bevestigd dat deze twee methoden specifiek meten verschillende soorten en subcellulaire lokalisatie van ROS in Dictyostelium. Tenslotte kan de OBG assay worden aangepast aan elke hechtende fagocytische cellen, door verdere opsoniserende de bolletjes met liganden voor receptoren van dierlijke fagocytische cellen. In principe kan de DHE en AUR assays ook worden afgesteld voor metingen in alle aanhangend of nonadherent cel onder geschikte experimentele omstandigheden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Reactive oxygen species (ROS) bestaan ​​uit een reeks van reactief en kortstondige, zuurstofhoudende moleculen, die dynamisch worden interconverted of hetzij katalytisch of spontaan geëlimineerd. Door de korte levensduur van de meeste ROS en de diversiteit van hun bronnen en subcellulaire lokalisaties, kan een volledig beeld worden alleen verkregen door zorgvuldige metingen met behulp van een combinatie van protocollen. Hier presenteren we een set van drie verschillende protocollen gebruiken OxyBurst Groen (OBG)-gecoate kralen, of dihydroethidium (DHE) en Amplex Ultrared (AUR), kwalitatief en kwantitatief te monitoren verschillende ROS in professionele fagocyten zoals Dictyostelium. We geoptimaliseerd de kralen coating procedures en gebruikte OBG-gecoate kralen en live microscopie om dynamisch visualiseren intraphagosomal ROS generatie op de enkele cel niveau. Wij identificeerden lipopolysaccharide (LPS) van E. coli als een krachtige stimulator voor ROS generatie in Dictyostelium. Daarnaast hebben we developed real-time, het midden-throughput testen in DHE en AUR om kwantitatief te meten intracellulaire superoxide en extracellulaire H 2 O 2-productie, respectievelijk.

De generatie van ROS in phagosomes kan kwalitatief en dynamisch worden gevisualiseerd door microscopie (File S1). De rode fluorescentie uitgezonden door Alexa fluor 594 is pH-ongevoelig en blijft constant in de phagosomal milieu, terwijl de oxidatie van OBG verhoogt de fluorescentie in het groene kanaal. De emissiespectra van in vitro geoxideerd en nonoxidized OBG-gecoate korrels worden vergeleken in Figuur 1B, die een significante toename in intensiteit na oxidatie. Om visuali...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Doe-het-zelf-Inrichting voor Herstel van gecryopreserveerde monsters per ongeluk laat vallen in cryogene opslagtanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Knaagdier Werken Heart Model voor de Studie van hartspierprestatie en Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Oprichting van een extracellulaire zure pH cultuur systeem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...