Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à MM Karl-Heinz Krause et Vincent Jaquet de l&#39;aide et des conseils pour mettre en place ces protocoles, et remercions également Christoph Bauer et Jérôme Bosset de la plate-forme de bio-imagerie du PRN et le Dr Navin Gopaldass pour leur soutien technique. La recherche est financée par une subvention de DocPro du Fonds national suisse.

Une. Visualisation et de mesure qualitative de la production de ROS dans phagosomes Les perles OBG enduits doivent être préparés à l&#39;avance. Les procédures de revêtement de perles et technique de gélose sont adaptés de références publiées 5,14. <ol><li> Ajouter 1 ml de la suspension de 3,0 um billes de silice carboxylés (environ 1,8 x 10 9 billes) dans un tube de 1,5 ml, laver les billes 3 fois avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et tourbillonne...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Par rapport aux procédés décrits précédemment, le dosage OBG visualise dynamiquement le processus de génération de ROS phagosome au niveau de la cellule unique, au lieu de mesurer un signal moyen ROS partir d&#39;une population de cellules. Ces méthodes population moyennes ont tendance à occulter des informations critiques causés par phagocytose non synchrone. Nous avons adapté avec succès DHE et AUR essais de Dictyostelium et optimisé les protocoles. Plus important encore, nous avons précisé les...

Les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques tels que la défense de l&#39;hôte, la signalisation, le développement tissulaire et réponse à la lésion, ainsi que l&#39;hypertension artérielle et du cancer. Le mécanisme de la NADPH oxydase phagosome bien étudié est dédié à la génération de ROS rapide, connu sous le burst oxydatif, pour tuer les bactéries ingérées dans les phagosomes de neutrophiles 1. En outre, les fuites d&#39;électrons comme un sous-produit de la chaîne respiratoire mitochondriale a déjà été pensé pour être responsable que d&#39;une source non réglementée de ROS. Mais récemment, il a été identifié comme un mécanisme important pour contribuer à la mise à mort intraphagosomal de bactéries dans les macrophages de souris 2. Au cours des dernières années, l&#39;amibe sociale, Dictyostelium, est devenu un modèle puissant et populaire pour étudier les mécanismes intrinsèques cellulaires de la réponse immunitaire innée. En effet, Dictyostelium et phagocytes humains partagent un niveau étonnamment élevé de conservation dans moleculales mécanismes responsables de la détection des bactéries, l&#39;engloutissement et tuer 3,4 r. Les homologues des protéines et des enzymes liées à la production ou à la détoxification des ROS, tel que NADPH oxydases, les catalases, les superoxyde dismutases, peuvent être trouvés à la fois humaine et de Dictyostelium. Comme l&#39;amibe mieux étudié, Dictyostelium présente plusieurs avantages uniques sur le système de modèle de mammifère. Ils se développent à la température ambiante sans la nécessité pour le CO 2, avec un temps de doublement de 8-10 h. Ils peuvent être facilement conservées sous forme de cultures adhérentes ou en suspension. En outre, grâce à leur génome haploïde entièrement séquencé et annoté, et à la manipulation génétique facile, Dictyostelium est devenu un modèle expérimental très attrayant organisme. Dans des études antérieures, divers dérivés chlorés et fluorés de fluorescéine (collectivement connu sous le nom OxyBurst Green, OBG) qui émettent une fluorescence après oxydation par ROS, ont été utilisés en tant que reporter ROS. Cellulaire infiltrant intérêtdérivés erified sont utilisés pour mesurer cytoplasmique ROS, alors-ou les dérivés du dextran couplés aux protéines cellulaires imperméant sont utilisés pour mesurer extracellulaire ROS. En particulier, des perles OBG BSA revêtues ont déjà été utilisés pour détecter la production de ROS phagosomale dans les cellules de mammifères 5. Cependant, l&#39;approche basée sur lecteur microplaque ne peut donner une courbe de génération de ROS moyenne d&#39;une population de cellules. Avec le présent protocole, en utilisant Dictyostelium, un phagocyte professionnel, et les conditions expérimentales optimisées, nous obtenons la phagocytose stable et efficace sans la conjugaison tout opsonine sur les billes. DHE a été utilisée dans divers systèmes modèles, tels que les neutrophiles et les macrophages de mammifères, pour détecter la production de ROS 9.6. Pendant ce temps, il ya des controverses sur la spécificité et la sensibilité de la méthode 8,10. Comme une version améliorée de Amplex Red, l&#39;intensité de fluorescence de AUR est moins sensible au pH, ce qui le rend plus approprié pour mesurerROS dans les milieux non-neutres ou faiblement acides. AUR a récemment été appliquée dans plusieurs systèmes de mammifères 11,12, mais son utilisation dans les modèles non-mammifères, qui nécessitent souvent des milieux de croissance faiblement acide, n&#39;a pas encore été signalé. En outre, il n&#39;existe pas de protocole publié à mesurer quantitativement et dynamiquement la production de ROS et la localisation dans l&#39;amibe sociale Dictyostelium. Le but du jeu présenté des protocoles est de fournir une solution simple et souple pour surveiller divers ROS et leur localisation, et en outre donner un aperçu des mécanismes cellulaires ROS-liés. Pour le dosage OBG, nous avons utilisé la microscopie en direct pour surveiller l&#39;ensemble du processus de génération de ROS phagosome après absorption de perles OBG revêtues par des cellules Dictyostelium, et proposons une nouvelle approche pour étudier le mécanisme de destruction intraphagosomal de bactéries. Nous avons optimisé moyen débit DHE et AUR essais dans Dictyostelium, pour mesurer superoxyde intracellulaireide et de H 2 O 2 extracellulaire production, respectivement, à l&#39;aide de LPS comme un stimulateur puissant de ROS. Notez que le LPS a été récemment montré pour augmenter l&#39;activité bactéricide de Dictyostelium vers bactéries phagocytées 13. En outre, le traitement par DEDTC et de la catalase a confirmé explicitement que ces deux méthodes mesurent spécifiquement différents types et localisations subcellulaires de ROS dans Dictyostelium. Enfin, le dosage OBG peut être adapté à n&#39;importe quelle cellule phagocytaire adhérente, par opsonisation en outre les perles avec des ligands pour les récepteurs phagocytaires des cellules animales. En principe, les tests DHE et AUR peuvent également être affiné pour les mesures dans une cellule adhérente ou non adhérente dans des conditions expérimentales appropriées.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) comprennent une gamme de molécules contenant de l&#39;oxygène réactif et de courte durée, qui sont dynamiquement interconvertis ou éliminées soit catalytique ou spontanément. En raison de la durée de vie courte de la plupart des ROS et la diversité de leurs sources et localisations subcellulaires, une image complète peut être obtenue que par des mesures précises en utilisant une combinaison de protocoles. Ici, nous présentons un ensemble de trois protocoles différents à l&#39;aide OxyBurst vert (OBG) revêtu perles, ou dihydroethidium (DHE) et Amplex Ultrared (AUR), de suivre qualitativement et quantitativement différents ROS dans les phagocytes professionnels tels que Dictyostelium. Nous avons optimisé les procédures de revêtement de perles et perles occasion OBG-enduits et microscopie en direct de visualiser dynamiquement intraphagosomal génération de ROS au niveau d&#39;une seule cellule. Nous avons identifié le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli comme un puissant stimulateur de la production de ROS dans Dictyostelium. En outre, nous Dtemps réel eveloped, essais à moyen débit utilisant DHE et AUR à mesurer quantitativement dismutase intracellulaire et H 2 O 2 de production extracellulaire, respectivement.

La génération de ROS dans les phagosomes peut être visualisé qualitativement et de façon dynamique par microscopie (S1 du fichier). La fluorescence rouge émise par Alexa Fluor 594 est insensible au pH et reste constante dans le milieu de phagosome, tandis que l&#39;oxydation de OBG augmente sa fluorescence dans le canal vert. Les spectres d&#39;émission de oxydé in vitro et non oxydés OBG perles revêtues sont comparées sur la figure 1B, montrant une augmentation sign...

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Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

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