Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר קרל היינץ קראוזה ווינסנט ג&#39;וקס לעזרה וייעוץ להקמת פרוטוקולים אלה, וגם להודות כריסטוף באואר וג&#39;רום Bosset מפלטפורמת bioimaging של NCCR וד&quot;ר Navin Gopaldass לתמיכה הטכנית שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק ProDoc של שוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. ויזואליזציה ומדידה איכותית של ROS הייצור בPhagosomes צריכים להיות מוכנים חרוזים מצופים OBG מראש. נהלי ציפוי חרוזים וטכניקת כיסוי אגר מעובדים מאזכור פורסם 5,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של הש...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

בהשוואה לשיטות שתוארו קודם לכן, assay OBG דינמי מדמיין את התהליך של יצירת ROS phagosomal ברמת התא הבודד, במקום למדוד אות ROS ממוצעת מאוכלוסייה של תאים. שיטות אוכלוסיית מיצוע כאלה נוטים לטשטש מידע קריטי הנגרם על ידי phagocytosis nonsynchronous. אנחנו הסתגלנו בהצלחה מבחני DHE וAUR לDictyostelium ומ?...

מיני חמצן תגובתי (ROS) מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת מארחת, איתות, פיתוח רקמות ותגובה לפציעה, כמו גם יתר לחץ דם וסרטן. מכונות מונואמין NADPH phagosomal למדו היטב מוקדשת לדור ROS המהיר, המכונה פרץ חמצוני, כדי להרוג חיידקי בלע בphagosomes &#39;נויטרופילים 1. בנוסף, זליגה של אלקטרונים כתוצר לוואי של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה חשבה בעבר להיות אחראי אך ורק למקור ללא פיקוח של ROS. אבל לאחרונה, זה זוהה כמנגנון חשוב לתרום להרג intraphagosomal של חיידקים במקרופאגים עכבר 2. בשנים האחרונות, האמבה החברתית, Dictyostelium, הפכה למודל רב עוצמה והפופולרי ללמוד מנגנונים פנימיים תא של תגובת החיסון המולדת. ואכן, Dictyostelium וphagocytes האנושי לשתף ברמה גבוהה באופן מפתיע של שימור בmoleculaמנגנונים r אחראים לחיידקים חישה, היבלעות והרג 3,4. Homologs של חלבונים ואנזימים הקשורים לייצור ROS או סילוק רעלים, כגון oxidases NADPH, catalases, dismutases סופראוקסיד, ניתן למצוא בשני בני אדם וDictyostelium. כמו האמבה למדה הטוב ביותר, Dictyostelium מציג מספר יתרונות ייחודיים על פני מערכת מודל של יונקים. הם גדלים בטמפרטורת חדר ללא הצורך בCO 2, עם זמן הכפלה של 8-10 לשעה. הם יכולים להיות כל הזמן בקלות כמו תרבויות חסיד או השעיה. בנוסף, הודות להגנום הפלואידים הרצף מלא והמבואר שלהם, ולמניפולציה גנטית קלה, Dictyostelium הפך אורגניזם מודל ניסיוני מאוד אטרקטיבי. במחקרים קודמים, נגזרים כלור ופלואור שונים של ההעמסה (הידועה קולקטיבי OxyBurst גרין, OBG) שפולט הקרינה לאחר חמצון על ידי ROS, שימש ככתב ROS. est Cell-permeantנגזרי erified משמשים למדידת ROS cytoplasmic, ואילו או dextran-נגזרי תא impermeant-חלבון בשילוב משמשים למדידת ROS תאי. בפרט, חרוזים מצופים BSA OBG כבר נעשו שימוש כדי לזהות ייצור ROS phagosomal בתאי יונקים 5. עם זאת, הגישה המבוססת על קורא microplate יכולה רק לתת עקומת דור ROS בממוצע מאוכלוסייה של תאים. עם הפרוטוקול הנוכחי, באמצעות Dictyostelium, תא בלען מקצועי, ותנאי ניסוי מותאמים, אנו מקבלים phagocytosis היציב והיעיל מבלי להטות כל opsonin על חרוזים. DHE נעשה שימוש במערכות שונות מודל, כגון נויטרופילים ומקרופאגים יונקים, כדי לזהות ייצור ROS 6-9. בינתיים, יש כמה מחלוקות על הסגוליות והרגישות של 8,10 השיטה. כמו גרסה משופרת של Amplex אדום, עוצמת הקרינה של AUR הוא פחות רגיש לחומציות, מה שהופך אותו מתאימים יותר למדידהROS בחוגי nonneutral או חומצי חלש. AUR הוחל לאחרונה במספר מערכות של יונקים 11,12, אך השימוש בו בדגמי nonmammalian, אשר לעתים קרובות דורשים תקשורת צמיחת חומצי חלש, לא דווח עד כה. בנוסף, אין פרוטוקול שפורסם כמותית ודינמית למדידת ייצור ROS ולוקליזציה באמבה החברתית Dictyostelium. המטרה של הקבוצה של פרוטוקולים שהוצגה היא לספק פתרון קל ותכליתי כדי לפקח ROS שונים והלוקליזציה שלהם, ועוד יותר לתת תובנות מנגנונים תאיים הקשורים ל-ROS. עבור assay OBG, השתמשנו במיקרוסקופ חי כדי לפקח על כל התהליך של דור ROS phagosomal לאחר הספיגה של חרוזים מצופים OBG ידי תאי Dictyostelium, וסיפק גישה חדשה כדי ללמוד את מנגנון הרג intraphagosomal של חיידקים. יש לנו אופטימיזציה מבחני DHE וAUR בינוני תפוקה בDictyostelium, למדוד superox תאיתIDE ו-H 2 O 2 תאי ייצור, בהתאמה, על ידי שימוש בLPS כממריץ ROS חזק. שים לב שLPS הוצג לאחרונה על הגדלת פעילות bactericidal של Dictyostelium כלפי חיידקי phagocytosed 13. בנוסף, הטיפול בDEDTC וקטלאז במפורש אישר כי שתי השיטות הללו באופן ספציפי למדוד סוגים שונים ומגויר subcellular של ROS בDictyostelium. לבסוף, assay OBG יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic חסיד, על ידי opsonizing נוסף חרוזים עם ligands לקולטנים phagocytic של תאי חיים. באופן עקרוני, מבחני DHE וAUR יכולים להיות גם למדידות בכל תא חסיד או nonadherent תחת תנאי ניסוי מתאימים מכויל.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

מיני חמצן תגובתי (ROS) מהווים מגוון של מולקולות וקצרות מועד, המכיל חמצן, שהם באופן דינמי interconverted או בוטלו או catalytically או באופן ספונטני. בשל אורך חיים הקצר של רוב ROS והגיוון של מקורותיהם והמגוירים subcellular, ניתן לקבל תמונה שלמה רק על ידי מדידות מדוקדקות באמצעות שילוב של פרוטוקולים. כאן, אנו מציגים סט של שלושה פרוטוקולים שונים באמצעות OxyBurst גרין (OBG) מצופה חרוזים, או dihydroethidium (DHE) וAmplex UltraRed (AUR), כדי לפקח איכותי וכמותית ROS השונים בphagocytes המקצועי כגון Dictyostelium. אנו מותאמים נהלי חרוזים ציפוי וחרוזים מצופים OBG משומשים ומיקרוסקופיה חיות לדמיין דור ROS intraphagosomal דינמי ברמת התא הבודד. זיהינו lipopolysaccharide (LPS) מE. coli כממריץ רב עוצמה לייצור ROS בDictyostelium. בנוסף, אנו דזמן אמת eveloped, מבחני בינוני תפוקה באמצעות DHE וAUR למדוד באופן כמו סופראוקסיד תאיים ו-H 2 O 2 תאי ייצור, בהתאמה.

הדור של ROS בphagosomes ניתן דמיינו איכותי ודינמי על ידי מיקרוסקופ (S1 קובץ). הקרינה האדומה הנפלטת על ידי Alexa פלואוריד 594 היא pH-רגיש ונשאר קבוע בסביבת phagosomal, בעוד חמצון של OBG מגביר הקרינה שלו במסלול הירוק. ספקטרום הפליטה של במבחנה מתחמצן וחרוזים מצופים OBG nonoxidized מו...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...