Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

हम मदद और इन प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए सलाह के लिए डीआरएस कार्ल हेंज Krause और विन्सेंट JAQUET के आभारी हैं, और भी उनके तकनीकी सहायता के लिए NCCR की Bioimaging प्लेटफार्म और डॉ. नवीन Gopaldass से क्रिस्टोफ Bauer और जेरोम Bosset धन्यवाद. अनुसंधान स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन की एक ProDoc अनुदान द्वारा समर्थित है.

1. दृश्य और phagosomes में आरओएस उत्पादन का गुणात्मक मापन OBG लिपटे मोतियों पहले से तैयार रहना चाहिए. मोती कोटिंग प्रक्रियाओं और अगर ओवरले तकनीक प्रकाशित संदर्भ 5,14 से अनुकूलित कर रहे हैं. <ol><li> एक 1.5 ?...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

पहले से वर्णित तरीकों की तुलना में, OBG परख गतिशील रूप बजाय कोशिकाओं की आबादी से एक औसत आरओएस संकेत को मापने की, एकल कोशिका के स्तर पर phagosomal आरओएस पीढ़ी की प्रक्रिया visualizes. इस तरह जनसंख्या के औसत के तरीकों nonsynchron...

रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) ऐसे मेजबान रक्षा, संकेतन, ऊतक विकास और चोट के जवाब के साथ ही उच्च रक्तचाप और कैंसर के रूप में जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता में शामिल हैं. अच्छी तरह से अध्ययन phagosomal NADPH oxidase मशीनरी neutrophils &#39;phagosomes 1 में किया जाता बैक्टीरिया को मारने के लिए, oxidative फट के रूप में जाना जाता है तेजी से आरओएस पीढ़ी, के लिए समर्पित है. इसके अलावा, mitochondrial श्वसन श्रृंखला के प्रतिफल के रूप में इलेक्ट्रॉनों का रिसाव पहले से ही आरओएस के एक अनियमित स्रोत के लिए जिम्मेदार माना गया था. लेकिन हाल ही में, यह माउस मैक्रोफेज 2 में बैक्टीरिया की intraphagosomal हत्या के लिए योगदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र के रूप में पहचान की थी. हाल के वर्षों में, सामाजिक अमीबा, Dictyostelium, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सेल आंतरिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और लोकप्रिय मॉडल बन गया है. दरअसल, Dictyostelium और मानव फ़ैगोसाइट molecula में संरक्षण की एक आश्चर्यजनक उच्च स्तर का हिस्साबैक्टीरिया, घिराव संवेदन और 3,4 हत्या के लिए जिम्मेदार आर मशीनरी. प्रोटीन और जैसे NADPH oxidases, catalases, superoxide dismutases रूप आरओएस उत्पादन या detoxification, से संबंधित एंजाइमों की homologs, मानव और Dictyostelium दोनों में पाया जा सकता है. सबसे अच्छा अध्ययन किया अमीबा के रूप में, Dictyostelium स्तनधारी मॉडल प्रणाली पर कई अद्वितीय लाभ प्रस्तुत करता है. वे 8-10 घंटे का दोहरीकरण समय के साथ, सीओ 2 के लिए आवश्यकता के बिना कमरे के तापमान पर बढ़ता है. वे आसानी से पक्षपाती या निलंबन संस्कृतियों के रूप में रखा जा सकता है. इसके अलावा, उनकी पूरी तरह से अनुक्रम और एनोटेट अगुणित जीनोम के लिए, और आसान आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए धन्यवाद, Dictyostelium एक बहुत ही आकर्षक प्रयोगात्मक मॉडल जीव बन गया है. पिछले अध्ययनों में, आरओएस द्वारा ऑक्सीकरण के बाद प्रतिदीप्ति फेंकना कि (सामूहिक OxyBurst ग्रीन, OBG के रूप में जाना जाता है) fluorescein के विभिन्न क्लोरीनयुक्त और fluorinated डेरिवेटिव, एक आरओएस पत्रकार के रूप में इस्तेमाल किया गया है. सेल permeant स्थासेल impermeant dextran या प्रोटीन युग्मित डेरिवेटिव कोशिकी आरओएस को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाता है जबकि erified डेरिवेटिव, cytoplasmic आरओएस को मापने के लिए किया जाता है. विशेष रूप से, OBG बीएसए लिपटे मोतियों पहले से ही स्तनधारी कोशिकाओं 5 में phagosomal आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, microplate रीडर आधारित दृष्टिकोण केवल कोशिकाओं की आबादी से एक औसत आरओएस पीढ़ी वक्र दे सकते हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, Dictyostelium, एक पेशेवर भक्षककोशिकीय, और अनुकूलित प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग करके, हम माला पर किसी भी opsonin conjugating बिना स्थिर और कुशल phagocytosis प्राप्त करते हैं. DHE आरओएस उत्पादन 6-9 पता लगाने के लिए इस तरह के स्तनधारी neutrophils और मैक्रोफेज के रूप में विभिन्न मॉडल प्रणाली, में इस्तेमाल किया गया है. इस बीच, विधि 8,10 की विशिष्टता और संवेदनशीलता पर कुछ विवादों रहे हैं. Amplex लाल, AUR को मापने के लिए यह अधिक उपयुक्त बनाता है जो पीएच, के प्रति संवेदनशील है की प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक उन्नत संस्करण के रूप मेंNonneutral या दुर्बलता से अम्लीय milieus में आरओएस. AUR हाल ही में कई स्तनधारी सिस्टम 11,12 में लागू किया गया है, लेकिन अक्सर कमजोर अम्लीय विकास मीडिया की आवश्यकता होती है जो nonmammalian मॉडल, में इसके उपयोग अभी तक रिपोर्ट नहीं दी है. इसके अलावा, मात्रात्मक और गतिशील सामाजिक अमीबा Dictyostelium में आरओएस उत्पादन और स्थानीयकरण को मापने के लिए कोई प्रकाशित प्रोटोकॉल है. प्रोटोकॉल की प्रस्तुत सेट के लक्ष्य के विभिन्न आरओएस और उनके स्थानीयकरण पर नजर रखने के लिए एक आसान और बहुमुखी समाधान प्रदान करते हैं, और आगे आरओएस से संबंधित सेलुलर तंत्र में अंतर्दृष्टि दे रहा है. OBG परख के लिए, हम Dictyostelium कोशिकाओं द्वारा OBG लिपटे मोतियों के तेज के बाद phagosomal आरओएस पीढ़ी की पूरी प्रक्रिया की निगरानी के लिए लाइव माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया, और बैक्टीरिया के intraphagosomal हत्या की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान की है. हम intracellular superox को मापने के लिए, Dictyostelium में मध्यम throughput DHE और AUR assays अनुकूलित हैएक शक्तिशाली आरओएस उत्तेजक के रूप में LPS का उपयोग करके क्रमशः आईडीई और बाह्य एच 2 ओ 2 उत्पादन,. LPS हाल ही में phagocytosed बैक्टीरिया 13 की ओर Dictyostelium की जीवाणुनाशक गतिविधि बढ़ाने के लिए दिखाया गया था कि ध्यान दें. इसके अलावा, DEDTC और Catalase के साथ इलाज के लिए स्पष्ट रूप से इन दो तरीकों विशेष रूप से विभिन्न प्रकार और Dictyostelium में आरओएस के subcellular localizations उपाय पुष्टि की. अंत में, OBG परख आगे पशु कोशिकाओं की phagocytic रिसेप्टर्स के लिए ligands के साथ मोती opsonizing द्वारा, किसी भी पक्षपाती phagocytic सेल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. सिद्धांत रूप में, DHE और AUR assays भी ठीक tuned उपयुक्त प्रयोगात्मक शर्तों के तहत किसी भी पक्षपाती या nonadherent सेल में मापन के लिए किया जा सकता है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) गतिशील interconverted या या तो catalytically या अनायास समाप्त हो जाते हैं, जो प्रतिक्रियाशील और अल्पकालिक, ऑक्सीजन युक्त अणुओं की एक श्रृंखला शामिल है. कारण अधिकांश आरओएस और उनके स्रोतों और subcellular localizations की विविधता से कम जीवन spans के लिए, एक पूरी तस्वीर ही प्रोटोकॉल का एक संयोजन का उपयोग कर सावधान माप से प्राप्त किया जा सकता है. यहाँ, हम एक OxyBurst ग्रीन (OBG) का उपयोग करते हुए तीन अलग अलग प्रोटोकॉल का सेट में लिपटे मोतियों, या dihydroethidium (DHE) वर्तमान और Amplex UltraRed (AUR), गुणात्मक और मात्रात्मक ऐसे Dictyostelium के रूप में पेशेवर फ़ैगोसाइट में विभिन्न आरओएस नजर रखने के लिए. हम गतिशील एकल कोशिका के स्तर पर intraphagosomal आरओएस पीढ़ी कल्पना करने के लिए मोती कोटिंग प्रक्रियाओं और खेतों में OBG लिपटे मोतियों और लाइव माइक्रोस्कोपी अनुकूलित. हम ई. से (LPS) lipopolysaccharide पहचान Dictyostelium में आरओएस पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली उत्तेजक के रूप में कोलाई. इसके अलावा, हम घeveloped वास्तविक समय, मात्रात्मक क्रमशः, intracellular सुपरऑक्साइड और बाह्य एच 2 ओ 2 उत्पादन को मापने के लिए DHE और AUR का उपयोग मध्यम throughput assays.

phagosomes में आरओएस के पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (फ़ाइल S1) द्वारा गुणात्मक और गतिशील रूप से देखे जा सकते हैं. एलेक्सा Fluor 594 द्वारा उत्सर्जित लाल प्रतिदीप्ति पीएच के प्रति संवेदनशील है और OBG के ऑक्सीकरण ग्रीन च...

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Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

हम गुणात्मक और मात्रात्मक अध्ययन के लिए विभिन्न अमीबा और स्तनधारी सेलुलर मॉडल में लागू किया जा सकता है कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) की माप के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट अनुकूलित.

, का पता लगाने के लिये दृष्टि और एक अमीबा मॉडल प्रणाली में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी Quantitating

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

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