Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
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우리는 도움과 이러한 프로토콜을 설정하는 조언 박사 부부 칼 - 하인츠 크라우스와 빈센트 JAQUET에 감사하고, 또한 자신의 기술 지원 NCCR의 바이오 이미징 플랫폼 및 박사 나빈 Gopaldass에서 크리스토프 바우어 제롬 Bosset 감사합니다. 연구는 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 ProDoc의 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 시각화 및 phagosomes를있는 ROS 생산의 질적 측정 OBG - 코팅 된 비드를 미리 준비한다. 비즈 코팅 절차 및 한천 오버레이 기술은 출판 참조 5,14에서 적응됩니다. <ol><li> 1.5 ML 튜브에 3.0 μm의 카르 실리카 비드 (약 1.8 × 10 9 구슬) 1 ㎖ 현탁액을 추가, 비즈 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 1 ㎖의 PBS로 3 배 씻는다. </li><li> 25 ㎎ / ㎖ 시안 아미드를 (공유 BSA를 prela...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

전술 한 방법에 비해, OBG 분석법 동적 대신 세포 집단에서 보통 ROS 신호 측정, 단일 세포 수준에서 phagosomal ROS 생성의 과정을 시각화한다. 이러한 인구 평균 방법은 비동기 식균 작용에 의한 중요 정보를 모호하게하는 경향이있다. 우리는 성공적으로 Dictyostelium의에 DHE와 AUR 분석을 적용하고 프로토콜을 최적화. 가장 중요한 것은, 우리는이 두 가지 분석에 의해 측정 된 유형과 ROS의 세포 내 ?...

활성 산소 종 (ROS)는 같은 호스트 방어, 신호, 조직 개발 및 부상에 대한 응답뿐만 아니라 고혈압과 암과 같은 생물 학적 과정의 다양한 참여하고 있습니다. 잘 공부 phagosomal의 NADPH 산화 효소 기계는 호중구 &#39;phagosomes를 1 섭취 박테리아를 죽이고, 산화 버스트로 알려진 신속한 ROS 생성에 최선을 다하고 있습니다. 또한, 미토콘드리아 호흡 사슬의 부산물로서 전자의 누출은 이전에는 ROS의 규제 소스에 대한 책임을 져야하는 것으로 생각되었다. 그러나 최근에는 마우스 대 식세포 2 박테리아의 intraphagosomal 살인에 기여하는 중요한 메커니즘으로 확인되었다. 최근 몇 년 동안, 사회 아메바, Dictyostelium의는 타고난 면역 반응의 세포 고유의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력하고 인기있는 모델이되고 있습니다. 실제로, Dictyostelium의 인간 식세포는 molecula 보전의 놀라 울 정도로 높은 수준을 공유박테리아, 말림을 감지하고 3,4 살인에 대한 책임을 R의 기계. 단백질과 같은 NADPH 산화 효소, 카탈라제, 슈퍼 옥사이드 dismutases으로 ROS의 생산 해독 관련 효소의 동족체는, 인간과 Dictyostelium의 모두에서 찾을 수 있습니다. 최고의 공부 아메바으로, Dictyostelium의 포유 동물 모델 시스템에 대한 몇 가지 독특한 장점을 제공한다. 그들은 8-10 시간의 배가 시간으로, CO 2에 대한 필요없이 상온에서 성장한다. 그들은 쉽게 부착 또는 현탁액 문화로 유지 될 수있다. 또한, 자신의 완전한 염기 서열과 주석 반수체 게놈, 쉬운 유전자 조작 덕분에, Dictyostelium의 매우 매력적인 실험 모델 생물이되고있다. 이전의 연구에서, ROS에 의한 산화 후 형광을 방출 (이하 OxyBurst 녹색, OBG라고도 함) 형광의 다양한 염소와 불소 유도체, ROS의 기자로 사용되어왔다. 세포 투과 동부 표준시휴대 impermeant 덱스 트란 또는 단백질 결합 유도체는 ROS 세포를 측정하기 위해 사용되는 반면 erified 유도체, 세포질 ROS를 측정하는 데 사용된다. 특히, OBG BSA 코팅 된 비드 이미 포유류 세포 소재 phagosomal ROS의 생성을 검출하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 마이크로 플레이트 리더 기반 접근법은 단지 세포 집단에서 평균화 ROS 생성 커브를 줄 수있다. 본 프로토콜로, Dictyostelium의 전문 식세포, 최적화 실험 조건을 사용하여, 우리는 구슬에 어떤 opsonin 공역없이 안정적이고 효율적으로 식균 작용을 구하십시오. DHE는 ROS 생산 6-9를 검출하는 그러한 포유류 호중구 및 대 식세포 등 다양한 모델 시스템에 사용되어왔다. 한편, 방법 8,10의 민감도와 특이도를 통해 몇 가지 논쟁이있다. Amplex 레드, AUR을 측정하는 것이 더 적합하다 산도에 덜 민감의 형광 강도의 개선 된 버전으로nonneutral 또는 약산성 milieus에서 ROS. AUR은 최근 여러 포유류의 시스템 (11, 12)에 적용되어 있지만, 꽤 자주 약산성 성장 미디어를 필요로 nonmammalian 모델에서의 사용은 아직보고되지 않았습니다. 또한, 정량적 동적 사회적 아메바 Dictyostelium의에서 ROS 생산 및 국산화를 측정 할 수있는 게시 된 프로토콜이 없습니다. 프로토콜 제시된 세트의 목표는 다양한 ROS 및 현지화를 모니터링하기 쉽고 다양한 솔루션을 제공하고, 또한 ROS 관련 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. OBG 분석을 위해, 우리는 Dictyostelium의 세포로 OBG 코팅 구슬의 흡수 후 phagosomal의 ROS 생성의 전 과정을 모니터링하는 라이브 현미경을 사용하고, 박테리아의 intraphagosomal 살인의 메커니즘을 연구하기 위해 새로운 접근 방식을 제공했다. 우리는 세포 내 superox을 측정하기 위해, Dictyostelium의 매체 처리량 DHE와 AUR 분석를 최적화강력한 ROS 자극으로 LPS를 사용하여 각각 IDE 및 세포 H 2 O 2 생산. LPS 최근 포식 균 (13)를 향해 Dictyostelium의의 살균 활성을 증가 표시했다합니다. 또한, DEDTC 및 catalase의 치료는 명시 적으로 두 가지 방법이 구체적으로 다양한 종류와 Dictyostelium의에서 ROS의 세포 내 현지화를 측정하는 것을 확인했다. 마지막으로, OBG 분석은 상기 동물 세포의 식세포 수용체에 대한 리간드와 함께 비즈 opsonizing 의해, 어떤 접착 식세포 세포에 적용 할 수있다. 원칙적으로, DHE와 AUR 분석은 미세 조정 적절한 실험 조건에서 어떤 부착 또는 비 접착 세포에서 측정 할 수있다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

활성 산소 종 (ROS)는 동적으로 상호 전환 또는 하나 촉매 또는 자발적으로 제거하는 반응과 짧은 수명, 산소 함유 분자의 범위를 포함한다. 때문에 대부분의 ROS와 그 소스와 세포 내 현지화의 다양성의 짧은 제품 수명에 완전한 그림은 프로토콜의 조합을 사용하여주의 측정에 의해 얻어 질 수있다. 여기에서, 우리는 OxyBurst 그린 (OBG)를 사용하여 세 가지 다른 프로토콜의 집합 코팅 구슬, 또는 dihydroethidium (DHE)를 제시하고 Amplex UltraRed (AUR)는 질적 및 양적 같은 Dictyostelium의 등 전문 식세포의 다양한 ROS를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 동적으로 단일 세포 수준에서 intraphagosomal ROS의 생성을 시각화하는 비즈 코팅 절차 및 사용 OBG 코팅 구슬과 라이브 현미경을 최적화. 우리는 E.에서 지질 다당류 (LPS)를 확인 Dictyostelium의에서 ROS의 생성을위한 자극제로 대장균. 또한, 우리는 거라고eveloped 실시간 정량적으로 각각 세포 내 과산화물 및 세포 H 2 O 2의 생산을 측정하기 위해 DHE와 AUR를 사용하여 중간 처리량 분석.

된 phagosomes에 ROS의 생성은 현미경 (파일 S1)에 의해 성적으로 동적으로 시각화 할 수 있습니다. 알렉사 형석 594에 의해 방출되는 적색 형광은 pH를 구분하고 OBG의 산화 녹색 채널의 형광을 증가하는 동안, phagosomal 환경에서 일정하게 유지된다. 체외의 방출 스펙트럼은 산화 nonoxidized OBG 코팅 비드 산화 후의 강도의 상당한 증가를 나타내는,도 1b에 비교된다. 라이브 이...

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Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

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