Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Vi er takknemlige til legene Karl-Heinz Krause og Vincent Jaquet for hjelp og råd til å sette opp disse protokollene, og også takke Christoph Bauer og Jérôme Bosset fra Bioimaging Platform av NCCR og Dr. Navin Gopaldass for deres tekniske støtte. Forskningen er støttet av en ProDoc bevilgning av den sveitsiske National Science Foundation.

En. Visualisering og Kvalitativ måling av ROS Produksjonen i phagosomes De OBG-belagte perler bør være forberedt på forhånd. Perlene belegningsprosedyrer og agar overlay teknikk er tilpasset fra publiserte referanser 5,14. <ol><li> Tilsett 1 ml suspensjon av 3,0 mikrometer karboksylerte silika perler (ca. 1,8 x 10 9 perler) til et 1,5 ml rør, vaske perlene 3x med 1 ml PBS ved hurtigsentrifugering og virvling. </li><li> Resuspender perlene i 1 ml PBS inneholdende...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Sammenlignet med de tidligere beskrevne metoder, OBG assay dynamisk visualiserer prosessen med phagosomal ROS generering på enkeltcelle-nivå, istedenfor å måle en gjennomsnittlig ROS-signal fra en populasjon av celler. Slike befolkningsGjennomsnitt metoder tendens til å skjule viktig informasjon forårsaket av nonsynchronous fagocytose. Vi vellykket tilpasset DHE og AUR-analyser til Dictyostelium og optimalisert protokollene. Viktigst, vi angitt hvilke typer og subcellulære lokaliseringer av ROS målt ved...

Reaktive oksygenarter (ROS) er involvert i en rekke biologiske prosesser som vertsforsvar, signalering, vev utvikling og respons på skade, så vel som hypertensjon og kreft. Den godt studert phagosomal NADPH oksidase maskiner er dedikert til rask ROS generasjon, kjent som den oksidative burst, for å drepe bakterier inntatt i nøytrofile &#39;phagosomes en. I tillegg ble lekkasje av elektroner som et biprodukt av den mitokondrielle respiratoriske kjeden tidligere antatt å være ansvarlig for bare en uregulert kilde ROS. Men i det siste, og ble identifisert som en viktig mekanisme for å bidra til intraphagosomal dreping av bakterier i musemakrofager 2. I de senere årene har det sosiale amøbe, Dictyostelium, bli en mektig og populær modell for å studere celle iboende mekanismer i det medfødte immunrespons. Faktisk Dictyostelium og humane fagocytter har en overraskende høy grad av konservering i molekylr machineries ansvarlige for bakterier sensing, engulfment og drepe 3,4. De homologer av proteiner og enzymer som er relatert til ROS eller avgiftning, slik som NADPH oksidase, catalases, superoxide Dismutases, kan finnes i human-og Dictyostelium. Som best studerte amøbe, presenterer Dictyostelium flere unike fordeler fremfor pattedyrmodellsystem. De vokser ved romtemperatur uten behov for CO2, med en dobling tid på 8-10 timer. De kan lett bli holdt som tilhenger eller suspensjonskulturer. I tillegg, takket være deres fullt sekvensert og annotert haploid genom, og til enkel genetisk manipulasjon, har Dictyostelium blitt en svært attraktiv eksperimentell modell organisme. I tidligere studier, diverse klorerte og fluorerte derivater av fluorescein (kollektivt kjent som OxyBurst Green, OBG) som avgir fluorescens etter oksidasjon av ROS, har blitt brukt som en ROS reporter. Cell-permeant esterified derivater benyttes til å måle cytoplasmatisk ROS, mens celle-impermeant dekstran-eller protein-koblede derivater benyttes til å måle ekstracellulære ROS. Spesielt har OBG BSA-belagte perlene som allerede er blitt brukt for å detektere phagosomal ROS-produksjon i pattedyrceller 5. Imidlertid kan det mikroplateleser baserte tilnærmingen bare gi et gjennomsnitt ROS generasjon kurve fra en populasjon av celler. Med dagens protokoll, ved hjelp av Dictyostelium, en profesjonell phagocyte, og optimaliserte eksperimentelle forhold, får vi stabil og effektiv fagocytose uten conjugating noen opsonin på perlene. DHE har vært brukt i forskjellige modellsystemer, slik som pattedyr nøytrofiler og makrofager, for å detektere ROS produksjons 6-9. I mellomtiden er det noen controversies over spesifisitet og sensitivitet for metoden 8,10. Som en forbedret versjon av Amplex Red, fluorescensintensiteten av AUR er mindre følsom overfor pH, noe som gjør det mer egnet til å måleROS i nonneutral eller svakt sure miljøer. AUR har nylig blitt brukt i flere pattedyr systemer 11,12, men bruken i nonmammalian modeller, som ganske ofte krever svakt syrlig vekstmedier, har ikke blitt rapportert ennå. I tillegg er det ingen publiserte protokoll til kvantitativt og dynamisk måle ROS produksjon og lokalisering i det sosiale amøbe Dictyostelium. Målet med den presenterte sett av protokoller er å gi en enkel og allsidig løsning for å overvåke ulike ROS og deres lokalisering, og videre gi innsikt i ROS-relaterte cellulære mekanismene. For OBG analysen, brukte vi leve mikros å overvåke hele prosessen med phagosomal ROS generasjon etter opptak av OBG-belagte perler av Dictyostelium celler, og gitt en ny tilnærming for å studere mekanismen av intraphagosomal drap av bakterier. Vi har optimalisert medium gjennomstrømming DHE og AUR-analyser i Dictyostelium, for å måle intracellulær superoxide og ekstracellulære H 2 O 2-produksjon, henholdsvis, ved hjelp av LPS som en potent stimulator ROS. Legg merke til at LPS ble nylig vist å øke den baktericide aktivitet av Dictyostelium mot phagocytosed bakterier 13. I tillegg behandling med DEDTC og katalase eksplisitt bekreftet at disse to metodene spesifikt måle ulike typer og subcellulære lokaliseringer av ROS i Dictyostelium. Endelig kan OBG assay tilpasses enhver vedheftende fagocytisk celle, ved ytterligere opsonizing perlene med ligander for fagocytiske reseptorer av dyreceller. I prinsippet kan de DHE og AUR-analyser også være finjustert for målinger i alle tilhenger eller ikke-festede celle under passende eksperimentelle forhold.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Reaktive oksygen arter (ROS) består av en rekke reaktive og kortlivede, oksygenholdige molekyler, som er dynamisk interconverted eller elimineres enten katalytisk eller spontant. På grunn av den korte liv spenner fra de fleste ROS og mangfoldet av sine kilder og subcellulære lokaliseringer, kan et fullstendig bilde oppnås bare ved forsiktig målinger ved hjelp av en kombinasjon av protokoller. Her presenterer vi et sett med tre forskjellige protokoller ved hjelp OxyBurst Grønn (OBG)-belagt perler, eller dihydroethidium (DHE) og Amplex UltraRed (AUR), for å overvåke kvalitativt og kvantitativt ulike ROS i profesjonelle fagocytter som Dictyostelium. Vi optimalisert perler belegningsprosedyrer og brukte OBG-belagte perler og live mikros å dynamisk visual intraphagosomal ROS generasjon på celle-nivå. Vi identifiserte lipopolysakkarid (LPS) fra E. coli som en potent stimulator for ROS generasjon i Dictyostelium. I tillegg vi developed sanntid, medium-throughput analyser ved hjelp DHE og AUR å kvantitativt måle intracellulær superoksid og ekstracellulære H 2 O 2-produksjon, hhv.

Den generasjonen av ROS i phagosomes kan visualiseres kvalitativt og dynamisk ved mikroskopi (File S1). Den røde fluorescensen avgitt av Alexa fluor 594 er pH-ufølsomme og forblir konstant i phagosomal miljø, mens oksydasjon av OBG øker dens fluorescens i den grønne kanalen. Utslipps spektra av in vitro oksidert og nonoxidized OBG-belagte perler er sammenlignet i figur 1B, som viser en betydelig økning i intensitet etter oksidasjon. For å legge til rette for visualiserin...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Vi tilpasset et sett av protokoller for måling av reaktive oksygenforbindelser (ROS) som kan brukes i ulike Amoeba og pattedyr cellulære modeller for kvalitative og kvantitative studier.

Oppdager, visualisere og kvantifisere generasjon av reaktive oksygen arter i en Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Generasjon, rensing og karakterisering av Cell-invasive Disc1 Protein Arter

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generering av merkede og Markerless Mutanter i Modell cyanobacterial Arter

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Gnager Working Hjerte modell for studier av hjerteinfarkt Ytelse og oksygenforbruk

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Visualisere de tidlige stadiene av Fagocytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...