Name: detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Vi är tacksamma till Dr Karl-Heinz Krause och Vincent Jaquet för hjälp och råd för att ställa in dessa protokoll, och även tacka Christoph Bauer och Jérôme Bosset från Bioimaging plattformen för NCCR och Dr Navin Gopaldass för deras tekniska support. Forskningen stöds av ett Prodoc beviljande av Swiss National Science Foundation.

1. Visualisering och Kvalitativ Mätning av ROS Produktion i phagosomes De OBG-belagda kulor bör förberedas i förväg. Pärlorna beläggningsförfaranden och agar overlay teknik är anpassade från publicerade referenser 5,14. <ol><li> Tillsätt 1 ml suspension av 3,0 ^ m karboxylerade kiseldioxidpärlor (ca 1,8 x 10 9 pärlor) i ett 1,5 ml rör, tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml PBS genom snabb dragning och virvling. </li><li> Återsuspendera pärlorna i 1 ml P...

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Jämfört med de tidigare beskrivna metoderna, OBG-analysen visualiserar dynamiskt processen för phagosomal ROS-generering vid den enda cellnivå, i stället för att mäta en genomsnittlig ROS-signal från en population av celler. Sådana befolkningsmedelvärdes metoder tenderar att skymma viktig information som orsakas av osynkron fagocytos. Vi framgångsrikt anpassat DHE och AUR analyser till Dictyostelium och optimerade protokollen. Viktigast av allt, vi specificerade typerna och subcellulära lokalisering...

Reaktiva syreradikaler (ROS) är involverade i en mängd olika biologiska processer såsom värdförsvar, signalering, vävnadsutveckling och svar på skada samt högt blodtryck och cancer. Den väl studerade phagosomal NADPH-oxidas maskiner är tillägnad snabb ROS generation, kallad oxidativ burst, för att döda bakterier som intas i neutrofiler &quot;phagosomes 1. Dessutom har läckage av elektroner som en biprodukt av den mitokondriella andningskedjan tidigare trott för att vara ansvarig endast för en oreglerad källa till ROS. Men nyligen har det identifierats som en viktig mekanism för att bidra till intraphagosomal dödandet av bakterier i musmakrofager 2. Under de senaste åren har den sociala amöba, Dictyostelium, blir en kraftfull och populär modell för att studera cell inneboende mekanismer i det medfödda immunsvaret. Faktum Dictyostelium och mänskliga fagocyter delar en förvånansvärt hög nivå av bevarande i molecular maskinerier ansvariga för bakterier avkänning, omvälvning och dödar 3,4. De homologer av proteiner och enzymer som rör ROS produktion eller avgiftning, såsom NADPH oxidaser, kata, superoxiddismutaser, kan finnas i både mänskliga och Dictyostelium. Som bäst studerade amöba, Dictyostelium presenterar flera unika fördelar jämfört med däggdjur modellsystem. De växer vid rumstemperatur utan behov av CO 2, med en dubbleringstid av 8-10 timmar. De kan lätt hållas så vidhäftande eller suspensionskulturer. Dessutom, tack vare sin helt sekvense och kommenterad haploidgenom, och till enkel genetisk manipulation, har Dictyostelium blivit en mycket attraktiv experimentell modellorganism. I tidigare studier, olika klorerade och fluorerade derivat av fluorescein (kollektivt kallas OxyBurst Green, OBG) som avger fluorescens efter oxidation av ROS, har använt som en ROS reporter. Cell-permeant esterified derivat används för att mäta cytoplasma ROS, medan cell impermeant dextran-eller protein-kopplade derivat används för att mäta extracellulära ROS. I synnerhet har OBG BSA-belagda pärlor redan använts för att detektera phagosomal ROS-produktion i däggdjursceller 5. Däremot kan den mikroplattläsare synsätt bara ge ett genomsnitt ROS generation kurva från en population av celler. Med det nuvarande protokollet, med hjälp av Dictyostelium, en professionell phagocyte och optimerade experimentella förhållanden, vi får en stabil och effektiv fagocytos utan att konjugera någon opsonin på pärlorna. DHE har använts i olika modellsystem, såsom däggdjurs neutrofiler och makrofager, för att detektera ROS-produktionen 6-9. Samtidigt finns det en del kontroverser över specificiteten och känsligheten för metoden 8,10. Som en förbättrad version av Amplex Red, fluorescensintensiteten hos AUR är mindre känslig för pH, vilket gör det mer lämpligt för att mätaROS i nonneutral eller svagt sura miljöer. AUR har nyligen tillämpats i flera däggdjurssystem 11,12, men dess användning i nonmammalian modeller, som ofta kräver svagt surt tillväxtmedier, har inte rapporterats ännu. Dessutom finns det inga publicerade protokollet för att kvantitativt och dynamiskt mäta ROS produktion och lokalisering i sociala amöba Dictyostelium. Målet med den presenterade uppsättning protokoll är att ge en enkel och mångsidig lösning för att övervaka olika ROS och deras lokalisering, och vidare ge insikter i ROS-relaterade cellulära mekanismer. För OBG analysen använde vi lever mikroskopi för att övervaka hela processen med phagosomal ROS generation efter upptag av OBG-belagda kulor av Dictyostelium celler, och som en ny metod för att studera mekanismen för intraphagosomal dödandet av bakterier. Vi har optimerat medel genomströmning DHE och AUR analyser i Dictyostelium, för att mäta intracellulära Superoxide och extracellulär H2O 2 produktion, respektive, genom att använda LPS som en potent ROS stimulator. Observera att LPS nyligen visat sig öka den antibakteriella effekten av Dictyostelium mot fagocyteras bakterier 13. Vidare behandling med DEDTC och katalas uttryckligen bekräftat att dessa två metoder mäter specifikt olika typer och subcellulära lokaliseringar av ROS i Dictyostelium. Slutligen kan OBG analysen anpassas till alla vidhäftande fagocytisk cell, genom att ytterligare opsoniserande pärlorna med ligander för fagocytiska receptorer av djurceller. I princip kan de DHE och AUR analyser också finjusteras för mätningar i fastsittande eller nonadherent cell under lämpliga experimentella förhållanden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Reaktiva syreradikaler (ROS) omfattar en rad reaktiva och kortlivade, syreinnehållande molekyler, som dynamiskt interkonverteras eller elimineras antingen katalytiskt eller spontant. På grund av den korta livslängden för de flesta ROS och mångfalden av sina källor och subcellulära lokaliseringar, kan en fullständig bild erhållas endast genom noggranna mätningar med hjälp av en kombination av protokoll. Här presenterar vi en uppsättning av tre olika protokoll att använda OxyBurst Grön (OBG)-belagda kulor, eller dihydroethidium (DHE) och Amplex UltraRed (AUR), för att kvalitativt och kvantitativt övervaka olika ROS i professionella fagocyter såsom Dictyostelium. Vi optimerat Pärlorna beläggningsförfaranden och begagnade OBG-belagda pärlor och live-mikroskopi för att dynamiskt visualisera intraphagosomal ROS generation på enskild cellnivå. Vi identifierade lipopolysackarid (LPS) från E. coli som en potent stimulator för ROS generation i Dictyostelium. Dessutom har vi developed realtid, medel throughput analyser med hjälp av DHE och AUR att kvantitativt mäta intracellulär superoxid och extracellulärt H2O 2 produktion, respektive.

Genereringen av ROS i phagosomes kan visualiseras kvalitativt och dynamiskt genom mikroskopi (File S1). Den röda fluorescens som emitteras av Alexa Fluor 594 är pH-okänslig och förblir konstant i phagosomal miljön, medan oxidation av OBG ökar dess fluorescens i den gröna kanalen. Den emissionsspektra för in vitro-oxiderade och icke-oxiderad OBG-belagda pärlor jämförs i Figur 1B visar en signifikant ökning i intensitet efter oxidation. För att underlätta visualiser...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Vi anpassade en uppsättning protokoll för mätning av reaktiva syreradikaler (ROS) som kan tillämpas i olika amöba och däggdjurs cellulära modeller för kvalitativa och kvantitativa studier.

Att upptäcka, Visualisering och kvantifiering Generation av reaktiva syreradikaler i en Amoeba modellsystem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualisera bultande hjärta i Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Electron Spin Resonance Micro-avbildning av Live Arter för Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Generation, rening och karakterisering av Cell-invasiva arter DISC1 Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generering av Markerade och Markerless mutanter i Model Blågrön Art

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Gnagare Working Heart modell för studier av Myocardial prestanda och syreförbrukning

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Visualisera de tidiga stadierna av Fagocytos

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Inrättandet av en extracellulär sura pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...