Name: nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Joseph W. Ndieyira werd ondersteund door Engineering and Physical Sciences Research Council (EPRSC), Interdisciplinair Research Centrum in Nanotechnologie (IRC), de Royal Society (RS) en Biano consultancy (BNC). Wij danken, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment en Gabriel Aeppli voor nuttige discussies.

1. Voorbereiding van Cantilevers <ol><li> Met behulp van Teflon pincet onderdompelen geselecteerd aantal cantilever chips (elke cantilever van 500 micrometer lang, 100 micrometer breed en 0,9 micrometer dik) in een vers bereide piranha-oplossing (bij 1:1 H 2 SO 4 en H 2 O 2) voor 20 min . </li><li> Na ongeveer 20 minuten verwijder de cantilever chips van piranha-oplossing en spoel ze met gedemineraliseerd water en breng deze onmiddellijk over in een vers bereide piranha oplossing. Herhaal stap 1.1 hierboven als de chips bevatten vlekken van vuil anders verder naar de volgende stap. </li><li> Na een grondige reiniging in gedeïoniseerd water, spoelen met zuiver ethanol en droog de cantilever chips op een verwarmingsplaat bij 75 ° C om eventuele sporen water te verwijderen. Inspecteer ze met behulp van een optische microscoop om hun netheid te bevestigen. </li><li> Breng de gereinigde cantilever chips op een verdampingskamer en pomp omlaag, gericht op een vacuüm bereikendruk van 10 mbar -7. </li><li> Wanneer de gewenste onderdruk bereikt is, laag een zijde van elke cantilever array met 2 nm titanium eerste dient als hechtlaag voor een extra laag van 20 nm dik goud. Om hun dikte te bevestigen, gebruik kwartskristal beeldscherm geplaatst direct boven de gewenste bron. </li><li> Vertrekken goud gecoate cantilever sensor chips in de kamer voor 1-2 uur afkoelen onder vacuüm voor de opening. </li><li> Breng de vers afgedampt chips een vacuüm voorraadvat gevuld met argon tot elke vorm van verontreinigingen te voorkomen. </li></ol> 2. Cantilever Chip Functionalisering <ol><li> Eerst regelen micro-capillaire buisjes op een functionalisering stadium 2 volgens de cantilever pitchgrootte 250 urn. </li><li> Injecteer daarna 2 mM ethanolische oplossingen thiol oppervlakte doelmoleculen, bijvoorbeeld bacteriële mucopeptides (D-Ala en D-Lac), en een &quot;zoekert &#39;alkaanthiol eindigend in triëthyleenglycol (PEG) bekend te weerstaan ​​biomoleculaire adsorptie. 16 Elk van de capillaire buizen moeten een gevarieerd oppervlak capture moleculen willekeurig vastbesloten gebruiker vertekening te voorkomen bevatten. </li><li> Volgende incubeer gedurende 20 minuten de uitkragingen in de microcapillairen gevuld met thiol oplossingen die oppervlakte vastleggen moleculen. Zorg ervoor dat de oplossingen van het oppervlak vangende moleculen zijn beperkt op ieder cantilever sensor kruisbesmetting te voorkomen of te minimaliseren. Als dit proces correct wordt toegepast, moet het systematisch veranderen van de vers bereide goud gecoate uitkragingen in chemisch actieve sensoren gevormd doordat ZAM&#39;en van bacteriële mucopeptide doelen te vormen op goud gecoate oppervlakken zoals receptoren. </li></ol> 3. Oplossing Voorbereidingen <ol><li> Los 0,1 M mono-en di-basisch natriumfosfaat zouten in ultrazuiver water (18,2 MQ-cm resistiviteit) en meng to opbrengst een pH waarde van 7,4. </li><li> Voeg 0.002% van PS80 de gebufferde oplossingen aggregatie veroorzaakt door niet-specifieke interacties van geneesmiddel moleculen en glaswerk minimaliseren. </li><li> Verdunnen met vers drugs gebufferde oplossingen de gewenste verschillende concentraties waarmee berekening van Kd. </li><li> Filter de vers bereide geneesmiddeloplossingen met 0,2 urn filters en sonicatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur vóór spoelen met argon. </li><li> Herhaal de procedure met de drug in gebufferd serum met behulp van hele serum. Voorzichtig vortex gedurende 15 min met extra 5 minuten tot volledige oplosbaarheid te waarborgen. </li></ol> 4. Oppervlak Stress Detection <ol><li> Laad een gefunctionaliseerde cantilever sensor chip in een vloeistofstroom celkamer. </li><li> Lijn de laserspot op het vrije uiteinde van elke sensor en bevestig de uitlijning met de verwarming van de vloeistofkamer van 1 ° C. Alle acht gouden coating cantilever sensorreeksen moet compre ondergaanssive neerwaartse buiging vanwege het bimetaal effect wordt veroorzaakt door het verschil in uitzetting tarieven van silicium en goud. </li><li> Na verhitting gedurende ongeveer 10 minuten, zodat de cantilevers afkoelen verdere 10 minuten. </li><li> Bereken het buigen variatie in de maximale buiging signalen tussen individuele cantilever sensoren en als de relatieve standaardafwijking van de bending signalen ≤ 5% aanvaarden, kan de uitlijning wenselijk het proces anders te herhalen. </li><li> Vervolgens meet de resonantiefrequenties van alle acht uitkragingen hun veerconstanten berekenen. Als de variatie van de veerconstante tussen elke cantilever sensor binnen een chip is ≤ 1% aanvaarden, kan de chip als hebbende consistente mechanische eigenschappen anders de cantilever chip sensor vervangen. </li><li> Vervolgens gebruikt u een fluidisch systeem (Model Genie Plus) via een zes-weg klep op de vloeibare uitwisseling binnen de stroom cel te bereiken, terwijl het verzamelen van gegevens moet worden bereikt met behulp van een geautomatiseerd LabView zodatftware. </li><li> Om de cantilever buigen gegevens controleren, gebruikt u de volgende meting protocollen: i) te injecteren ofwel bufferoplossing of serum zonder geneesmiddel voor controlemeting blijvende gedurende 5-30 min tot een basislijn vast te stellen; ii) injecteert drugs oplossing voor 30-60 min; iii) injecteren 10 mM HCl wassen voor 10-60 min tot gebonden medicijncomplex distantiëren; iv) ten slotte een verdere wasstap met bufferoplossing voor een ander 5-30 min naar de oppervlakte peptiden regenereren en de basislijn signaal te herstellen injecteren. Zorg er altijd voor dat alle signalen worden verkregen onder constante vloeistofstroom van 30-180 pl / min en bij vaste temperatuur van 25 ° C in een temperatuurgecontroleerde kast. </li><li> De absolute buigen signalen van alle acht uitkragingen moet worden gecontroleerd met behulp van seriële tijd multiplex optische bundel methode met een enkele positie gevoelige detector. </li><li> Om het buigen signalen van elke concentratie van geneesmiddel analyseren, worden de resulterende differentiaal bochten omgezet in een differentiële stress tussen de boven-en onderzijden van de cantilever met Stoney&#39;s vergelijking. </li></ol>

<ol>
	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

Geen belangenconflicten wordt verklaard

Deze resultaten demonstreren dat cantilever matrix sensoren hebben de gevoeligheid te detecteren en kwantificeren veranderingen in drug-doelbinding interacties vooral vancomycineresistentie geassocieerd met de deletie van een H-binding van de drug bindingsplaats. We tonen een nanomolar detectie gevoeligheid van Van in overeenstemming met eerdere Surface Plasmon Resonance (SPR) studies 18,19, en onthullen dat de cantilever methode direct drugmolecules kan detecteren en kwantificeren in bloed bij klinisch relevante concentraties zoals routinematig toegepast in de klinische praktijk. Onze gegevens suggereren dat de verschil oppervlaktespanning kan worden beschreven door een productvorm vergelijking (1), namelijk (i) een chemisch term die de specifieke geneesmiddel-target binding events, en (ii) een geometrische term die de mechanische verbinding tussen chemisch reageren oppervlakteplaatsen, hetgeen impliceert dat de lokale chemische interacties loskoppelen van de wereldwijde monteural interacties van de cantilever. Terwijl de chemische term wordt gegeven door de klassieke Langmuir adsorptie isotherm, de geometrische term onthult een percolative mechanisme van het geneesmiddel-target veroorzaakte oppervlaktespanning verandert. De kritische drempel pc ~ 10% (figuur 5) was nodig om de differentiële cantilever buigen detecteren, blijkt dat oppervlaktespanning wordt collectief getransduceerd wanneer een relatief groot oppervlak deel wordt ingenomen door antibiotische moleculen. Voor p ≥ pct, de mechanische verbinding tussen chemisch worden omgezet oppervlakteplaatsen wordt geleidelijk aan, en de korte afstand afstotende interacties zoals sterische interacties tussen de knooppunten van het netwerk nanomechanical geeft aanleiding tot toenemende neerwaartse buiging van het gehele cantilever. Er wordt gespeculeerd dat onze nanomechanical percolatiemodel een belangrijke rol kunnen spelen in de glycopeptide antibioticum werkingsmechanisme in real bacteriën. Deze bevindingen benadrukken de hoge gevoeligheid van de cantilever-technologie voor studying modus antibiotica &#39;van de actie en vormen een nieuw onderzoeksinstrument voor het bestuderen van drugs om het begrip van de werking van antibiotica bij de nano-schaal te verbeteren om te informeren en in staat stellen ontdekking van krachtige geneesmiddelen om de problemen van de superbacterie infecties te controleren. Om de cantilever systeem voor te bereiden op reproduceerbare en gevoelige metingen, hebben we een reeks van doelen in het protocol aan bod, met name voor het monster laden in microfluïdische cel en standaard operationele procedures om kwantitatieve nanomechanical detecties toe. Betekenis van cantilever-technologie met betrekking tot bestaande methoden Samengevat wijzen wij erop dat, terwijl deze technologie werd meer dan 25 jaar geleden voorgesteld, heeft hij niet zijn weg gevonden in de kliniek wegens gebrek aan zorgvuldige en herhaalde metingen op medisch relevante doelen. Hier laten we de procedures die de relevantie van het gebruik nanomechanical uitkragingen aan de monteur te onderzoeken vastal invloed van antibiotica op de bacteriële celwand doelstellingen en antibacteriële resistentie detecteren. Conventionele drug screening vereisen een soort van fluorescente of radioactieve labeling of een reportermolecuul om de binding van een analyt aan zijn doel, vaak in combinatie met een competitieve binding of enzymatische assay en eiwitassays 20 meten. Labeling van biomoleculen is niet alleen tijdrovend en duur, maar het label kunnen ook interfereren met de moleculaire interactie belemmeren van de bindingsplaats leidt tot valse negatieven. Bovendien, fluorescerende verbindingen vaak hydrofoob wat kan leiden tot achtergrondbinding en valse positieven. Door deze beperkingen is er een toenemende belangstelling voor nieuwe label-free technieken die vrijwel elke moleculair complex te screenen met minimale assay ontwikkeling. De meest gevestigde label-free oppervlak technologieën op dit moment zijn SPR en kwartskristalmicrobalans (QCM). In tegenstelling tot SPR die maatregel the diëlektrische constante, een label - free cantilever detecteert de oppervlaktespanning die door een ligand-receptor interactie, die direct meten nanomechanical krachten die ontstaan ​​door de specifieke binding van liganden aan oppervlaktereceptoren. Het unieke van deze sensoren is dat hun gevoeligheid niet afhankelijk diëlektrische eigenschappen veroorzaakt door de massa door de analyt bindend in SPR QCM maar op een kleinste geïnduceerde verandering in het vlak oppervlaktespanning, waardoor de technologie uitermate geschikt te bestuderen de Nanomechanica van drugs moleculen in klinisch relevante antibiotica concentraties (3-27 uM) 17. Cantilevers zijn ook bijzonder geschikt voor kleine moleculen (bijvoorbeeld DNA-fragmenten en drugs) detectie onder fysiologische omstandigheden waaronder complexe omgevingen die grotendeels de basis van de farmaceutische industrie en derhalve dienen als aanvulling in drug discovery. Cantilever technologie met succes zijn in de toegepastegebied van genomics 3,5, gas-sensing 21, proteomics 22, en drugs 1. Bovendien zijn uitkragingen vervaardigd met behulp van goedkope silicium technologie en vanwege hun verenigbaarheid met microfabrication processen, kan uitkragingen worden verkleind voor een betere gevoeligheid en parallellisatie in grote arrays van sensoren voor meerdere geneesmiddelen compound screening en hogere doorvoersnelheid informatierijke screeningstesten. Verbeteringen van de instrumentatie en de experimentele opzet zal een breed scala van interacties te analyseren in real-time te helpen vooraf de zoektocht naar een nieuwe generatie van superdrugs om de problemen van multidrug-resistente infecties te pakken. Kritische stappen in het protocol De ontwikkeling van robuuste meetprotocollen staat centraal in de toepassingen van deze technologie. Om bevredigende kwantitatieve drug-target metingen te bereiken en om de laagste concentratie van antibiotica t bepalenhoed kon worden gedetecteerd in buffer of bloedserum, kritische stappen in het protocol waren gericht. De eerste taak bestaat tuning en optimalisatie van oppervlakte-capture chemie aan cantilever detectie specificiteit en sensitiviteit te verbeteren. Ontegenzeggelijk, oppervlaktespanning transductie is een collectief verschijnsel, waarbij een relatief groot deel van het te bestrooien oppervlak te stellen verbinding tussen chemisch reactieve regio. We tonen aan dat door het variëren van de dichtheid van de ondergrond peptiden, een kritische drempel ~ p ≥ 10%, wordt bepaald wanneer de oppervlaktespanning schaal als functie van peptide dichtheid en anders nul (figuur 5). Het is belangrijk dat experimenten zijn ontworpen om de uniformiteit van spanning langs de cantilevers onderzoeken maximale signaal doorbuigingen voor gevoelige metingen te garanderen. Daarnaast kan een efficiënt oppervlakte regeneratie protocollen moeten worden in de plaats, waardoor meervoudige cyclus metingen en kosten voor elke tes verminderent. Bij het ontwerpen van een receptoroppervlak met gethioleerd hydrofoob einde, oriëntatie van het receptor molecuul en tussenruimte is essentieel om zelfassemblage van dichte pakking door Van-der-Waals interacties tussen de moleculen om niet-specifieke interacties te minimaliseren. Verder moet de vangende moleculen polyethyleenglycol (PEG) linker bevatten zodat een deel van de sensor matrix hydrofiel zijn om het inbrengen van moleculen voorkomen in de analytoplossing zich direct reageren met de onbeklede goudoppervlak. De PEG-linker-moleculen moeten fungeren als afstandhouders aan sterische beperkingen te verminderen en daarom laat de oplossing analyten om specifiek interactie met het oppervlak receptoren tot meetbare oppervlakte spanning verandering te bewerkstelligen. De cantilever matrix sensor worden getest ten minste een in situ referentiemeting en het signaal weergegeven in real-time een differentieel afbuiging, verkregen door van de absolute afwijking van de referentie cantilever van de sEnsing uitkragingen. Dus een verwijzing cantilever is essentieel om voor niet-specifieke interacties, zoals temperatuurveranderingen, veranderingen in de brekingsindex of interacties op het niet-gefunctionaliseerde onderzijde van de cantilever. Optimalisering van het debiet (~ 30-150 ul / min) vormt een cruciale stap in het protocol, omdat het zorgt voor de efficiënte uitwisseling van vloeistoffen en een voldoende constante massatransport van oplossing materialen. Het ontwerp van een vloeistof cel moet toelaten optimale volume (5-80 ul) voor snelle debieten tot perfecte vloeibare uitwisseling vervoer beperkingen massa te overwinnen stellen. Het debiet is vooral van belang bij het ​​uitvoeren van kinetische metingen 23. Groot volume vloeistofkamers vereisen oncontroleerbare hoge debieten leidt tot grote steekproef volume-eisen, die onnodig verhoogt de prijs van de test. Eerder hebben we gebruikt zwaartekracht om verschillende monsters te injecteren in de meting vloeistofkamer. Zwaartekracht heeft het voordeel dat het does geen mechanische onderdelen nodig en dus geen extra ruis niet invoeren in het systeem. Echter, de belangrijke nadeel is dat het alleen betrouwbaar werkt bij relatief hoge stroomsnelheden (-200 pl / min). Uiteraard zou een lager debiet (≤ 1 pl / min) beperkte monstervolume per tijdseenheid vereist, maar anderzijds maakt de reactie veel trager en vergt derhalve langere contacttijden. Bovendien zwaartekracht een grote variatie in de stroomsnelheid als het afhankelijk van de hoogte tussen de inlaat en de uitlaat, dat afneemt monsteroplossingen verbruikt tijdens het experiment. De zwaartekracht flow problemen te voorkomen, moet een injectiepomp worden gebruikt. Het voordeel van een spuitpomp is dat het een constant debiet over een lange termijn om de experimenten worden uitgevoerd in een gecontroleerde omgeving. Beperkingen van het protocol De grote uitdaging voor een reproduceerbaar eend specifieke biologische detectie middels cantilever sensoren als ervoor wordt gezorgd dat de eigenschappen van de ontvanglaag biochemisch &quot;actief&quot; en uniform voor elke assay. Het geheim van het experimentele succes is op een zorgvuldige voorbehandeling van de sensor chip met een gestandaardiseerde reiniging en immobilisatie protocol met linker chemicaliën te oriënteren de receptor moleculen in hun actieve conformatie. In onze huidige opstelling, functionalize we cantileverarrays met kleine glazen capillairen, die zouden kunnen worden onderworpen aan een aantal nadelen en kan problematisch zijn in sommige gevallen. Deze glazen capillairen aan beide uiteinden open en derhalve het monster oplosmiddelen gemakkelijk verdampen. Bijvoorbeeld, als de temperatuur van de functionalisering fase niet goed gecontroleerd, de verdampingssnelheid kan aanzienlijk variëren op verschillende tijdstippen met name bij het gebruik van vluchtige oplosmiddelen zoals ethanol. Er is ook een mogelijkheid om kleine variatie in de incubatietijd van de ene naar de andere cantilever given met het sensor vloeistoffen achter elkaar in de haarvaten worden geladen. De andere beperkende factor in capillaire functionalisering is het ontbreken van de mogelijkheid zodat cantilevers altijd in de haarvaten worden ingevoegd op dezelfde manier. Bovendien, soms de uitkragingen moeten iets worden getrokken uit de haarvaten om kruisbesmetting te voorkomen als de vloeibare monsters kan stromen op de chip lichaam. We kunnen deze problemen door gebruik inkjet spotters als alternatieve coating procedure coat uitkragingen. Hoewel de precieze controle monster coating zou de mogelijkheid opschaling voor grote arrays, de meest voorkomende nadeel is dat de kleine druppels die worden afgezet op de cantilevers kan verdampen binnen enkele seconden en vereist een gecontroleerde vochtigheid. Daarom is de incubatietijd niet gemakkelijk aangepast, hetgeen wenselijk voor sommige toepassingen kunnen zijn. Het subtiele samenspel van de factoren zoals sample volume, incubatietijd en verdampingssnelheid hebben directe invloed op de blootstelling van de uitkragingen aan de functionalisering monster en zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen geoptimaliseerde oppervlakchemie voor cantilever testen zoals elke kleine variatie in de receptor moleculaire dichtheid zal een groot effect hebben op de cantilever hebben respons. Proefopzet modificaties (dwz alternatieve technieken of materialen) Om de grote uitdaging in het verkrijgen van reproduceerbare coating procedure voor de toekomstige ontwikkeling van de cantilever technologie te overwinnen, zijn verschillende strategieën nodig die uitkragingen geïntegreerd in microfluïdische kanalen zou gebruiken. Het idee is dat speciale cantilever chips moeten zo worden ontworpen dat elke cantilever is geplaatst in een eigen kanaal om online te kunnen in situ functionaliseringsreacties procedures waar de kanalen individueel worden aangepakt. Deze experimentele opzet wijzigingen zouden coating proces te voerened in een gecontroleerde omgeving en gesloten wanneer de blootstelling aan het oplosmiddel nauwkeurig wordt gecontroleerd door de incubatietijd en de stroomsnelheid voor geautomatiseerde immobilisatie van vangende moleculen op cantilever chips. Dezelfde kanalen kunnen dan worden gebruikt voor de eigenlijke binding experimenten waarbij alle cantilevers kunnen worden blootgesteld aan dezelfde analyt oplossing. Naast de cantilever functionalisering procedure, zou de cantilever uitlezing mechanisme ook verbetering behoeven. De optische bundel deflectie methode is extreem gevoelig en is met succes gebruikt in Atomic Force Microscopy (AFM) technologie voor vele jaren. Niettemin wordt voor de vrijstaande cantilever sensor toepassingen de optische uitlezing heeft een aantal nadelen, bijvoorbeeld dat geen metingen in ondoorzichtige vloeistoffen zoals bloed toelaten, kan de uitlijning van een array van lasers tijdrovend en vervelend en de huidige configuratie kan geen onderscheid tussen kantelen en verticale doorbuiging. Dus de toekomstige ontwikkeling van de cantilevER-technologie zal moeten aspecten van de algemene sensor ontwerp (bv. cantilever geometrieën) en de cantilever uitlezing voor robuuste meetprotocollen zowel in het veld en laboratorium omgevingen te overwegen. Manalis en collega&#39;s hebben 22 nieuwe soorten holle cantilever sensoren waar de cantilevers hebben een ingesloten microfluïdische kanaal binnen de straal ontwikkeld, waardoor het apparaat in een vacuüm met hoogwaardige factoren te worden bediend. In deze modus cantilevers als microbalans 22 en derhalve niet langer noodzakelijk om een asymmetrie tussen de twee zijden ten opzichte functionalisering, waardoor de vangende moleculen kunnen worden gefysisorbeerd of covalent direct bevestigd aan het silicium, waarbij typisch SAMs of silanen 24. De cantilevers kunnen ook worden gemodificeerd met een dunne polymeerlaag die vervolgens geconjugeerd aan antilichamen 25 voor biochemische detectie. Problemen oplossen Een gemeenschappelijke probleem verband met de cantilever metingen de introductie van luchtbellen in de microfluïdische stroom cel. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd in de vloeibare cel tijdens de montage van de chip. Signaal drifting is ook een ander veel voorkomend probleem veroorzaakt door de verschillen in de temperatuur van de monsters. De uitkragingen moet evenwicht te stabiliseren alvorens metingen worden uitgevoerd. Alle buffers, analyten en regeneratie oplossingen worden opgeslagen in dezelfde ruimte als de cantilever instrument om alle oplossingen dezelfde temperatuur hebben. Hoewel de spuitpomp zeer nauwkeurig en zeer lage debieten kan leveren, wordt algemeen geassocieerd met mechanische ruis in de metingen cantilever. Het is daarom belangrijk om een ​​eenvoudige en effectieve noise reducer ontwikkelen minder geluid in de afbuigsignalen voorkomen. Het geluid reducer bestaat uit kleine vloeistofreservoir tussen de spuitpomp en de vloeistof cel, die t absorbeerthij mechanisch geluid uit de pomp. Vanwege de gevoelige aard van de optische detector, moet de cantilever meetsysteem idealiter worden bediend in een gesloten opstelling om elke verdwaalde lichten blokkeren interfereren met de optische uitlezing systeem. Daarnaast kan de kwaliteit van het registrerende lagen aanzienlijk af als een groot aantal wasstappen uitgevoerd op de cantilevers beperking van de levensduur van de sensor chip. Alternatieve of toekomstige toepassingen na mastering deze techniek Cantilevers bekleed met SAMs eindigend in een amino-of carboxyl-groep kan worden gebruikt als pH-sensoren. De functionele eindgroepen protoneren of deprotoneren afhankelijk van de pH van de oplossing en een oppervlaktelading die de cantilever buigen 24 leidt genereren. Gezien het feit dat de cantilever sensoren medicijn-target interacties in verband met de destabilisatie van de celwand van bacteriën leven 1,6,7 kunnen volgen, zullen ze dan ook helpen bij hethet zoeken en voor de ontwikkeling van een nieuwe generatie antibiotica bestrijding resistente infecties. In de toekomst uitkragingen zou worden gebruikt als microbalansen aan de massa en het groeitempo van enkele cellen 26 te meten. De cantilever technologie zal blijken gunstig voor de studie van cellulaire reacties op verschillende groeifactoren of drugs. Het zal ook een nieuw instrument voor snelle detectie van meerdere biomarkers, die direct belang in de medische en point-of-care toepassingen heeft. Gezien de veelzijdigheid, de kleine oppervlakte, en de robuustheid van cantilever sensoren, zullen ze een gevoelige beeldscherm van schadelijke omgevingsfactoren vormen. Zij hebben hun gevoeligheid bij het ​​detecteren giftige en schadelijke gassen die ontsnappen uit het laboratorium en industriële productie-eenheden in het milieu, zoals fluorwaterstofzuur of 27 blauwzuur 28 aangetoond.

De moleculaire herkenning paradigma ten grondslag ligt aan grote delen van de biologie en de geneeskunde. In farmacologie, bijvoorbeeld het doel is te interfereren met een pathologische route via manipulatie een sleutelelement van een biochemisch proces zoals transglycoslyation of transpeptidatie dat de verknoping van bacteriële celwand peptiden katalyseert. Het ontwerp van nieuwe geneesmiddelen wordt daarom gereduceerd tot het bepalen van een geschikte molecule aan een specifieke bacteriële docking plaats richten tot een perfecte pasvorm te induceren. Een klassiek voorbeeld emuleren het succes van deze benadering is vancomycine (Van), die peptidoglycaan celwand, een geconserveerd structureel kenmerk van een bacterie richt. In een opkomende Gram-positieve bacterie, het peptidoglycan matrix omvat peptiden resulteert in de sequentie Lysine-D-alanine-D-alanine, gebonden via een C55 linker lipide 8-10 hier genoemd D-Ala. Deze blootgesteld peptiden op de peptidoglycaan voorlopers zijn van fundamenteel belang voor demechanische bescherming van de bacteriële cellen tegen agressieve milieu krachten, en belangrijk, niet gevonden in humane cellen, waardoor ze ideaal doelen voor antibiotica. Van specifiek bindt aan het C-uiteinde van de bacteriële celwand peptiden die een matig sterk Van-peptide complex zoals weergegeven in figuur 1. Deze interactie tussen de blootgestelde en Van peptiden blokkeert de werking van transpeptidasen en transglycosylasen die katalyseren verknoping van de celwanden 1 hun effectief stoppen van verknoping en derhalve nanomechanically verzwakt de bacteriële cel leidt tot de dood door breuk 1,6, 7. De opkomst van vancomycine-resistente Enterococcus (VRE) is een groeiend gezondheidsprobleem 11 en omdat de bacteriële resistentie bij enterokokken ontstaat als gevolg van de subtiele veranderingen van een amide linkage een esterbinding 8 Dit bedrieglijk eenvoudige structurele veranderingen aan het oppervlak van de bacterie verwijdert een waterstofbinding van Van &#39;s docking site met latere wijziging van de bindende pocket. Belangrijk Dit proces verandert het pentapeptide terminal alanine aanwezig vancomycine gevoelige Enterococcus (VSE) een lysine-D-alanine-D-lactaat 10,12, hier aangeduid als D-Lac, wat een aanzienlijke vermindering in Van-D-Lac bindingsaffiniteit van drie ordes van grootte rendering Van therapeutisch ineffectief tegen enterokokkeninfecties 1, De alarmerende groei van antibioticaresistente bacteriën is dan ook het besturen van de ontwikkeling van innovatieve benaderingen te versnellen en het herstel van de antibacteriële werking van antibacteriële middelen of de ontdekking van meer krachtige drugs tegen multiresistente bacteriën infecties. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Onze experimenten met vrijstaande uitkragingen is geïnspireerd op de systemen zoals cellen die chemische energie benutten in beweging. Het vermogen van cantilever sensoren om chemische energie omzetten in mechanische beweging maakt ze uniek probes met aanzienlijke voordelen voor de controle van mechanische storingen bacteriële celwand doelen in real time. De cantilever sensoren vereisen geen journalist &#39;tags&#39; en biomoleculen worden snel gedetecteerd in een single-step reactie. Ze kunnen meerdere drugs screenen parallel onder fysiologische omstandigheden zoals gebufferde oplossingen en hele serum. Bovendien, de cantilever technologie gebruikt in situ referencing voor differentiële metingen waardoor ze drug-targetinteracties specifiek detecteren en, door hun fabricage via standaard routes halfgeleiderbewerking, die vatbaar zijn voor massaproductie en parallellisatie voor high-throughput screening van duizenden geneesmiddelen per uur. In het bĳzonderular meerdere cantilever sensorreeksen zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van antibiotica resistentie tegen vancomycine - omdat resistentie tegen vancomycine is in wezen een mechanisch probleem 1,6,7. De reacties tussen een model bacteriële celwand doel en Van in oplossing kan worden gedetecteerd door het volgen van de veranderingen in klinisch relevante spanning geïnduceerd door drugs-target binding interacties. De opgewekte spanning van de oppervlakte van reacties die zich manifesteert in een cantilever buigen signaal wordt optisch geanalyseerd door verhelderende sensoren met een laserstraal. Bovendien door het afstemmen van de coatinglaag van bacteriële oppervlak doelmoleculen bovenop de cantilever sensor, dichtbij een on-beperkt aantal analyten (Van), de specifieke biochemische interacties en de biomechanica van model bacteriële celwand matrix wordt gevolgd in real time. Naast de moleculaire gebeurtenis herkenning, zijn er verscheidene factoren die cantilever sensoren kunnen veroorzaken deflect, waaronder - temperatuurvariaties aspecifieke binding of veranderingen van de brekingsindex van de oplossing. Om rekening te houden niet-specifieke signalen in situ differentiële metingen worden uitgevoerd wanneer het buigen van zowel de meet-en referentie cantilevers worden continu bewaakt om specifieke interacties te analyseren. Bovendien kan de detectie gevoeligheden van cantilever sensoren die afhangen van de oppervlakte chemie en geometrie worden versterkt door het afstemmen van de oppervlaktedichtheid p (waarbij p is gedefinieerd als de verhouding van het oppervlak bezet door het vastleggen moleculen het gehele bovenoppervlak van de cantilever onder de totale populatie van moleculen zoals bepaald door X-stralen foto spectroscopie (XPS) 1. Hier dit protocol beschrijft hoe vancomycine of andere antibiotica binden aan bacteriële celwand precursor analogen (mucopeptides) bij klinisch relevante concentraties in gebufferde oplossing eennd bloedserum kan worden gedetecteerd door het gebruik van label-free cantilever-technologie. Verse goud oppervlakken worden gebruikt, omdat zelf-geassembleerde monolagen (SAM) hebben de neiging om gemakkelijk te vormen stabiele lagen op schone goud 13,14. SAMs bestaat typisch uit korte moleculen met een thiol covalent gehecht aan het gouden oppervlak, terwijl de gewenste invangeenheid aan het andere uiteinde vrij mag communiceren met de analyt targets in oplossing. Thiolen vormen een bijzonder flexibel systeem omdat veel thiol verbindingen met verschillende chemische eindgroepen zijn commercieel verkrijgbaar of worden gemakkelijk gesynthetiseerd in een laboratorium. Toch moet erop worden gelet dat moleculen met een thiolgroep het juiste eindgroepen moet, bijvoorbeeld een eiwit of peptide conjugatie, de aminogroep moet binnen gezicht voor de reactie met de carboxylgroep van de thiolgroep gebonden aan de oppervlak optreden. Hier, de thiolen waren direct geconjugeerd met tripeptide mimetica van bacteriële lipide II van de bacterial celwand doelstellingen gesynthetiseerd door vaste fase methode met behulp van commercieel beschikbare voorgeladen Wang-D-Ala en Wang-D-Lac harsen en de standaard Fmoc-beschermende groep chemie 15. Hoewel deze beschrijving is gericht op vancomycine, duidelijk kan worden uitgebreid tot andere antibiotica en ook verdere studies worden uitgenodigd door onderzoekers van verschillende gebieden bijzonder in de biochemie, farmacologie en materiaalkunde dit protocol voor hun eigen experimenten gemakkelijk vaststellen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

De cantilever sensor, die als een transducer van reacties tussen model bacteriële celwand matrix geïmmobiliseerd op het oppervlak en antibiotica in oplossing, blijkt belangrijk potentieel biochemische tasttoepassingen met ongekende gevoeligheid en specificiteit 1-5. De drug-targetinteracties genereren oppervlaktespanning, waardoor de cantilever buigen en kan het signaal optisch worden geanalyseerd wanneer deze wordt verlicht door een laser. De verandering in oppervlaktespanning gemeten nanoschaal precisie kan Storingen van de biomechanica van model bacteriële celwand doelstellingen worden bijgehouden in real time. Ondanks het aanbieden van aanzienlijke voordelen, hebben meerdere cantilever sensorreeksen nooit toegepast bij het kwantificeren van drug-target binding interacties. Hier beschrijven we het gebruik van silicium meerdere cantileverarrays bekleed met alkaanthiol zelf geassembleerde monolagen nabootsen bacteriële celwand matrix kwantitatief study antibiotica bindingsinteracties. Om het effect van vancomycine de mechanica van bacteriële celwand structuren 1,6,7 begrijpen. We ontwikkelden een nieuw model 1, waarin wordt voorgesteld dat cantilever buiging kan worden beschreven door twee onafhankelijke factoren i) te weten een chemische factor, die wordt gegeven door een klassieke Langmuir isotherm, waarvan we berekenen thermodynamische evenwicht dissociatieconstante (Kd) en ii) een geometrische factor in wezen een maat voor hoe bacterieel peptide receptoren zijn verdeeld over het oppervlak cantilever. De oppervlaktemineralen peptide receptoren (p) wordt gebruikt om de afhankelijkheid van de geometrie en ligand loading onderzoeken. Het blijkt dat een drempelwaarde van p ~ 10% is cruciaal voor sensortoepassingen. Waaronder er geen detecteerbaar signaal buigen terwijl boven deze waarde, het buigen signaal verhoogt bijna lineair, onthullen dat stress is een product van een lokale chemische binding factor en een geometrische factor gecombineerd door de mechanische verbinding van reageerden regio&#39;s en biedt een nieuw paradigma voor het ontwerp van krachtige middelen ter bestrijding superbacterie infecties.

De stress verandering gemeten met behulp van nano-schaal precisie met ongekende gevoeligheid voor een enkele H-binding verwijderen, wordt benut om de verstoringen van het model bacteriële celwand biomechanica te volgen in real-time (figuren 2a-d). De grens van drug detectiegevoeligheid voor Van werd onderzocht door serieel verdunnen van de concentratie in stappen van 1,000 uM tot ≤ 10 nM, 10 nM onthullen (~ 15 ng / ml) als de laagst detecteerbare concentratie die tot gemiddeld ± ~ -9 2 nm als differentiële signalen buigen (figuur 2c). De mogelijkheid om antibiotica onder fysiologische omgeving detecteren verder onderzocht in serum bij een klinisch relevante concentratiebereik van 3-27 uM 17. Na injectie van 7 uM Van in serum (90% foetaal kalfsserum plus 10% natriumfosfaatbuffer pH 7,4) voor alle cantilevers onder identieke omstandigheden, de verschilsignaal voorDala in serum was 105 ± 4 nm, terwijl voor DLac gecoat uitkragingen, geen buiging werd waargenomen (Figuur 3). De aanzienlijke buiging signalen waargenomen voor Dala coated (vancomycine gevoelige) cantilevers worden veroorzaakt door de sterke geneesmiddel-target binding interacties. Maar voor DLac coated (vancomycineresistente) cantilevers, de aanwezigheid van grondtoestand verdrijven van zuurstof eenzaam paar en de verlaagde NH binding in de vancomycine bindingsplaats 10,12 bijdraagt ​​aan de verzwakking van het geneesmiddel-target bindende interacties waardoor minder of geen cantilever buigen, in het bijzonder voor lagere concentraties vancomycine (figuur 3). Echter, voor de hoge concentratie vancomycine, zien we meetbare buigen signalen voor DLac. Bovendien, onze experimentele ontwerp is belangrijk voor in situ verwijzing waar alle cantilevers bekleed met zowel DaLa en DLac gelijktijdig aan dezelfde analyt in real time. Om de precieze rol van de chemie en geometrie begrijpen, ontwierpen we een model 1 beschrijft de correlatie tussen interacties oplosmiddel en het oppervlak mechanica. Dit levert de oppervlaktespanning: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> voor p&gt; pc en anders nul (1) De eerste term in vergelijking (1) is de Langmuir adsorptie-isotherm, goed voor medicijn-target binding evenementen en de tweede termijn is de kracht wet formulier in en beschrijf de grootschalige mechanische gevolgen van beklemtoonde netwerkvorming. De constante a komt overeen met maximale oppervlakte spanning wanneer alle toegankelijke bindingsplaatsen bezet zijn en Kd is de oppervlakte evenwichtsdissociatie consTant op de cantilever. De analyse zoals getoond in figuur 4 is het resultaat van de globale fit van de vergelijking (1) gesuperponeerd op gemeten differentiële spanningssignalen onthullen, een ~ 29,7 ± 1,0 en 14,1 ± 3,0 mN / m en Kd ~ 1,0 ± 0,3 800 ± 310 of uM voor D-Ala of DLac peptiden, wanneer een overeen met een mate van oppervlaktespanning wanneer alle toegankelijke bindingsplaatsen bezet. De verhoogde gevoeligheid van cantilever werd afgesteld door het systematisch variëren van de dichtheid p peptide tijdens het bewaken van de data spanning als functie van p terwijl antibiotica-concentraties vastgesteld op 10, 100 en 250 uM, respectievelijk (figuur 5). De werkwijze werd herhaald met spanning als functie van Van concentraties terwijl de peptide dichtheden vastgesteld op p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figuur 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. Cantilever detectie van antibiotica oppervlak bindingsinteracties. a) Schematische weergave van een cantilever sensor array en de wijze waarmee de geneesmiddel targetinteracties nanomechanically gedetecteerd. b) Chemische binding interactie tussen een geneesmiddel molecuul (Van) en bacteriële mucopeptide analoog (D-Ala of D-Lac). c) Het mechanisme waardoor een gemuteerde vancomycine gevoelige bacteriën (VSE) verwerft resistentie tegen vancomycine door het verwijderen een H-binding in de bindingsplaats. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figuur 2. Het volgen van de verstoringen van het model bacteriële celwand biomechanica in real time. a) Absolute buigen signalen van D-Ala, D-Lac en PEG gecoate cantilevers in fosfaatbuffer en 250 uM vancomycine. De differentiële PEG referentiesignalen worden in zwarte lijnen. B) Differentiële signalen buigen van D-Ala en D-Lac coating cantilevers in fosfaatbuffer en 250 uM vancomycine. C) Het verschil cantilever doorbuiging van een dosis afhankelijke signaal als functie van de tijd in de aanwezigheid van vancomycine concentraties in de orde van 10 nM (gele lijn), 100 nM (rode lijn) en 1000 nM (donkerrode lijn) resp. d) De differentiële cantilever doorbuiging signalen voor drie D-Ala gecoate cantilever sensoren als een functie van de tijd in de aanwezigheid van 10nM vancomycine. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figuur 3. Volgen van de verstoringen van het model bacteriële celwand biomechanica in real time voor een D-Ala en D-Lac coating cantilevers in aanwezigheid van 7 uM vancomycine drachtig foetaal serum. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Figuur 4. Onderzoek de nanomechanics van drug-targetinteracties. Grafiek die de gemeten differentiële oppervlaktespanning respons voor D-Ala (zwarte cirkels) en D-Lac (rode cirkels) bekleed cantilevers als functie van vancomycineconcentratie in oplossing [Van]. De gegevens worden beschreven door vergelijking (1) (doorgetrokken lijnen). 1 <img alt="Figuur 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figuur 5. Optimalisatie van nanomechanical detectiegevoeligheid van receptor-ligand interacties door het onderzoeken van de afhankelijkheid van receptor laden en geometrie via gemengde monolagen. Gemeten differentieel oppervlak stressresponsen vrijdragende sensors als functie van D-Ala oppervlaktebedekking, p in aanwezigheid van vaste concentraties vancomycine oplossing bij 10 uM (zwarte lijn), 100 uM (rode lijn), en 250 uM (groene lijn).

Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Verworven resistentie tegen antibiotica is een grote openbare gezondheidszorg probleem en is momenteel gerangschikt door de WHO als een van de grootste bedreigingen voor het menselijk leven. Hier beschrijven we het gebruik van cantilever technologie antibacteriële resistentie, kritisch voor de ontdekking van nieuwe en krachtige middelen tegen multidrug-resistente bacteriën te kwantificeren.

Nanomechanica van Drug-target Interacties en Antibacteriële Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

Een robuuste Longontsteking Model in Immunocompetente Knaagdieren om Antibacteriële Werkzaamheid Evalueer tegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; of<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotica-Dereplicatie met behulp van het antibioticumresistentie platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...