Name: nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Joseph W. Ndieyira была поддержана инженерным и физическим научным исследованиям Совета (EPRSC), Междисциплинарный центр исследований в области нанотехнологий (IRC), Королевское общество (RS) и Biano Consultancy (BNC). Мы благодарим, Алехандра Donoso Баррера, Dejian Чжоу, Мануэль Vögtli, Мэтью Батчелора, Мэтью А. Купер, Торстен Strunz, Тревор Рэймент и Габриэль Aeppli за полезные обсуждения.

1. Подготовка консолей <ol><li> Использование тефлоновой пинцетом погружают выбранного числа консольные чипы (каждый консольные измерения 500 мкм длиной, 100 мкм шириной и 0,9 мкм) в свежеприготовленный пираньи решение (в соотношении 1:1 H 2 SO 4 и H 2 O 2) в течение 20 мин . </li><li> Примерно через 20 минут удалить кантилевера чипы от пираний растворе и тщательно промойте их деионизированной воды и немедленно передать в свежеприготовленный пираньи решение. Повторите шаг 1.1 выше, если чипсы содержат пятна грязи в противном случае перейти к следующему шагу. </li><li> После тщательной очистки в деионизированной воде, промывают чистым этанолом и сушат кантилевера чипов на плите при температуре 75 ° С, чтобы удалить все следы воды. Проверьте их с помощью оптического микроскопа, чтобы подтвердить их чистоты. </li><li> Передача очищенный чипы для консольной испарительную камеру и откачивают, ориентации на достижение вакуумадавления 10 -7 мбар. </li><li> Как только необходимое давление вакуума достигается, флаг одной стороне каждой консольной матрицей с 2 ​​нм титан первый выступает в качестве адгезионного слоя перед дополнительным слоем золота 20 нм толщины. Чтобы подтвердить их толщины, используются кварцевые мониторе кристалл, помещенный непосредственно над источником сигнала. </li><li> Оставьте золото покрытием консольные фишки датчика в камере в течение 1-2 часов, чтобы охладиться под вакуумом до открытия. </li><li> Передача недавно выпаривали чипы для вакуумного хранения заполнены аргоном для предотвращения любых форм загрязнений. </li></ol> 2. Функционализация Консольные Chip <ol><li> Во-первых, организовать микро-капилляры на стадии функционализации 2 в зависимости от размера кантилевера шагом 250 мкм. </li><li> Затем вводят 2 мМ этанольного тиол растворы молекул целевой поверхности, т.е. бактериальных mucopeptides (D-Ala и D-Lac) и &quot;инерциальнойалкантиола т &#39;заканчивающуюся триэтиленгликоль (ПЭГ), известный противостоять биомолекулярных адсорбции. 16 Каждый из капиллярной трубки должна содержать различные поверхность захвата молекул определяется случайным образом, чтобы избежать смещения пользователь. </li><li> Следующий инкубируют в течение 20 мин консолей в микрокапиллярах заполнены растворов, содержащих тиольные поверхность захвата молекул. Убедитесь, что решения молекулами поверхности захвата приурочены на каждый отдельный датчик консольные, чтобы избежать или свести к минимуму перекрестного загрязнения. Если этот процесс работает правильно, это должно систематически изменяют свежеприготовленного покрытый золотом консолей в химически активные датчики сформированы, позволяя ЗРК бактериальных мукопептида целей, которые образуют на поверхностях, покрытых золотом, как рецепторы. </li></ol> 3. Решение подготовка <ol><li> Растворить 0,1 М моно-и ди-основные соли фосфата натрия в сверхчистой воде (18,2 мОм · см удельное сопротивление) и смесь тO получения значения рН 7,4. </li><li> Добавить 0,002% PS80 в буферных растворах, чтобы минимизировать агрегацию эффекты, вызванные неспецифических взаимодействий молекул лекарственного средства для посуды. </li><li> Развести препаратов с недавно буферном растворе до желаемой различных концентраций, которые позволят расчета K г. </li><li> Фильтр свежеприготовленного препарата решений с использованием фильтра 0,2 мкм и обработать ультразвуком в течение 5 мин при комнатной температуре, после продувки аргоном. </li><li> Повторите процедуру с наркотиками в буферном сыворотки с использованием цельной сыворотки. Аккуратно вихрь в течение 15 мин с еще 5 мин, чтобы обеспечить полную растворимость. </li></ol> 4. Обнаружение поверхностного напряжения <ol><li> Загрузите функционализированную сенсорного чипа консольные в жидкостную камеру проточную ячейку. </li><li> Выравнивание лазерное пятно на свободный конец каждого датчика и подтверждения выравнивания, нагревая жидкостной камере в течение 1 ° С. Все восемь золотых покрытием массивы датчиков консольные должны пройти комплексныеssive изгиба вниз из-за биметаллического эффекта, вызванного различия в скорости расширения кремния и золота. </li><li> После нагревания в течение примерно 10 мин, позволяют консоли остыть в течение еще 10 мин. </li><li> Вычислить изменение изгиба при максимальном изгибе сигналов между отдельными датчиками консольные и если относительное стандартное отклонение изгиба сигналов ≤ 5%, то принимают выравнивание как в противном случае желательно повторить процесс. </li><li> Далее, измерение резонансных частот всех восьми консолей, чтобы вычислить их жесткости пружины. Если изменение жесткости пружины между каждой консольной датчик в чип ≤ 1%, то принимают микросхеме последовательного механические свойства, в противном случае заменить датчик консольные чипа. </li><li> Затем с помощью жидкостной системой (модель Genie Plus) через шесть-ходовой клапан для достижения обмена жидкости в проточной ячейки в то время как сбор данных должна быть достигнута с использованием автоматизированной LabView такftware. </li><li> Для контроля изгиба кантилевера данных, используйте следующие протоколы измерений: I) вводят либо буферный раствор или сыворотки без препарата для контрольного измерения продолжительностью 5-30 минут, чтобы установить базовый; II) вводят лекарственный раствор в течение 30-60 мин; III) вводят 10 ммоль HCl мыть в течение 10-60 мин для диссоциации связан лекарственный комплекс, IV), наконец, вводят дополнительную стадию стирки с использованием буферного раствора в течение еще 5-30 мин, чтобы восстановить поверхность пептидов и восстановить базового сигнала. Всегда гарантировать, что все сигналы приобретенного при постоянной скорости потока жидкости из 30-180 мкл / мин и при фиксированной температуре 25 ° С в термостат. </li><li> Абсолютное изгиба сигналы всех восьми консолей следует контролировать с помощью последовательного временного мультиплексирования оптического метода луч с одним позиционно-чувствительный детектор. </li><li> Для анализа на изгиб сигналы от каждой концентрации препарата, в результате изгибания дифференциальный преобразуются в дифференциальные стресс между верхней и нижней сторонах кантилевера с использованием уравнения Стони. </li></ol>

<ol>
	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов не объявлен

Молекулярного распознавания лежит в основе парадигмы большие участки биологии и медицины. В фармакологии, например цель мешать патологический путь путем охвата ключевого участника биохимического процесса, таких как transglycoslyation или транспептидации, который катализирует сшивающего бактериальных пептидов клеточной стенки. Препарат дизайна сводится до определения подходящей молекулой для нацеливания на определенную бактериальных сайте док, чтобы побудить их идеальной подгонки. Классический пример эмуляции успех этого подхода является ванкомицин (Ван), которая ориентирована на пептидогликана клеточной стенки, консервативных структурной особенностью бактерии. В возникающей грамположительные бактерии, пептидогликана матрица состоит из пептидов, заканчивающуюся последовательность лизин-D-аланин-D-аланин, привязанные через C55 липидов линкера 8-10 здесь называют D-Ala. Эти обнаженные пептидов на пептидогликан прекурсоров являются основополагающими длямеханическая защита бактериальных клеток против суровых природных сил, а главное, не встречаются в клетках человека, что делает их идеальными целями для антибиотиков. Ван специфически связывается с С-конца клеточной стенки бактерий пептиды формирования умеренно сильный Ван-пептида сложные, как показано на рисунке 1. Это взаимодействие между Ван и подвергается пептидов блокирует действия transpeptidases и transglycosylases, которые катализируют сшивающего клеточных стенок 1, эффективно останавливая их сшивания и поэтому nanomechanically ослабляет бактериальной клетки приводит к его смерти разрыве 1,6, 7. Появление устойчивых к ванкомицину Enterococcus (VRE) является возрастающей проблемой здравоохранения 11 и потому, что в бактериальной резистентности энтерококков возникает из-за тонкое изменение амидной Линкагэ к сложноэфирной связью, 8, это обманчиво простой структурных изменений на поверхности бактерии удаляет одну водородную связь с Van &#39;с док сайт с последующей модификацией кармана связывания. Важно то этот процесс приводит к изменению пентапептидную настоящее аланин терминала в восприимчивых к ванкомицину энтерококков (VSE), чтобы лизин-D-аланин-D-лактат 10,12, здесь называются D-Lac, приводя к значительному снижению Ван-D-Lac аффинностью связывания по три порядка оказания Ван терапевтически неэффективны против инфекций Энтерококковый 1, тревожный рост устойчивых к антибиотикам бактерий, поэтому вождение развития инновационных подходов к ускорению и восстановлению антибактериальной активности антибактериальных агентов или обнаружение более мощных препаратов против множественной лекарственной устойчивостью бактериальных инфекций. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Наши эксперименты с использованием свободно стоящих консолях навеян системами, такими как клетки, которые использовать химическую энергию в движении. Способность консольные датчиков перевести химическую энергию в механическое движение делает их уникальными зондов с значительные преимущества для контроля механических сбоев бактериальной клеточной стенки цели в реальном времени. Консольные датчики требуют &quot;метки&quot; не репортер и биомолекул быстро обнаруживаются в пошаговом реакции. Они могут экранировать несколько препаратов параллельно в физиологических условиях, например, буферные растворы и цельной сыворотки. Кроме того, консольные технология использует на месте ссылок для дифференциальных измерений позволяет им специфического определения наркотиков целевой взаимодействий и, в силу их изготовления с помощью стандартных маршрутов обработки полупроводник, они поддаются для массового производства и распараллеливание для высокопроизводительного скрининга тысяч препаратов в час. В частУлар нескольких массивов датчиков консольные являются полезным инструментом для изучения устойчивости к антибиотикам ванкомицин - потому что сопротивление ванкомицин по существу механическая проблема 1,6,7. Реакции между моделью бактериальных целевой клеточной стенки и Ван в растворе может быть обнаружено путем мониторинга изменений в клинически значимых стресса, индуцированного от наркотиков мишень-связывающего взаимодействия. Сгенерированный напряжение от поверхностных реакций которое проявляется в изгиба кантилевера сигнал анализируется оптически путем освещения датчиков с лазерным лучом. Кроме того, адаптируя восприимчивы покрытие бактериальной поверхности молекулы-мишени на верхней части кантилевера датчик, рядом с неограниченным количеством аналитов (Ван), специфических биохимических взаимодействий и биомеханики модель бактериальной клеточной стенки матрицы мониторинг в реальном времени. Помимо признания молекулярные события, есть несколько факторов, которые могут вызвать консольные датчики для Defнию, временные которые включают в себя - изменения температуры, неспецифического связывания или изменения показателя преломления раствора. Для учета неспецифические сигналы, на месте дифференциальные измерения выполняются где изгиб как измерительного и опорного консолей постоянно контролируются для анализа конкретных взаимодействий. Кроме того, обнаружение чувствительности консольные датчики, которые зависят от поверхности химических и геометрических может быть повышена путем настройки поверхностной плотности р (где р определяется как отношение площади, занимаемой захвата молекул на всю площадь верхней поверхности кантилевера охватываемых общей численности населения молекул, как определено методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) 1. Вот этот протокол подробно описано, как ванкомицин или любой другой антибиотик связывания с клеточной стенки бактерий предшественников аналогов (mucopeptides) клинически значимых концентрациях в буферный растворй сыворотке крови могут быть обнаружены с помощью наклеек технология консоли. Свежие поверхности золота используются, потому что самоорганизующихся монослоев (ЗРК), как правило, легко образуют стабильных слоев на чистое золото 13,14. ЗРК обычно состоит из коротких молекул с тиолом ковалентно присоединен поверхности золота, тогда как целевой блок захвата на другом конце может свободно взаимодействовать с анализируемым веществом цели в растворе. Тиолов образуют гибкую систему особенно если учесть, что многие тиоловых соединений с различными концевыми группами химических являются коммерчески доступными или легко синтезированы в лаборатории. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что молекулы с тиолом фрагмента должны иметь правильную концевые группы, например, белок или пептид сопряжения, аминогруппа должна быть обращена внутрь для реакции с карбоновой группой тиола фрагмент привязаны на поверхность произойти. Здесь тиолами непосредственно конъюгированные с трипептид миметикам бактериальных липидов II от бacterial клеточной стенки целевых синтезированы твердые методологии с использованием коммерчески доступных предустановленной Ван-D-Ala и Ван-D-Lac смолы и стандартного Fmoc-защитную группу химии 15. Хотя это описание ориентирована на ванкомицин, очевидно, что оно может быть распространено на другие антибиотики и действительно дальнейших исследованиях приглашаются ученые из разных областей особенно в области биохимии, фармакологии и материаловедение легко принять этот протокол для своих экспериментов.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

Консольные датчик, который действует как преобразователь реакций между моделью бактериальной клеточной стенки матрицы иммобилизованным на его поверхности и антибиотиков в растворе, показал значительный потенциал в биохимических зондирования с беспрецедентной чувствительностью и специфичностью 1-5. Препарат-мишень взаимодействия генерировать поверхностное напряжение, в результате чего кантилевер сгибать, а сигнал может быть проанализирован оптически при освещении лазером. Изменение поверхностного напряжения измеряется нано-точностью позволяет нарушениями биомеханики модель клеточной стенки бактерий цели, которые необходимо отслеживать в реальном времени. Несмотря на предложение значительные преимущества, несколькими массивами датчиков консольные никогда не применялась в количественном наркотиков целевой связывающих взаимодействий. Здесь мы описываем использование кремний нескольких массивов консольные покрытые алкантиола самоорганизующихся монослоев имитируя бактериальной клеточной стенки матрицы количественно студенDy антибиотик связывающих взаимодействий. Чтобы понять влияние ванкомицин на механике клеточной стенки бактерий структур 1,6,7. Мы разработали новую модель 1, которая предлагает, чтобы изгиба кантилевера может быть описана двумя независимыми факторами, я), а именно химический фактор, который дается классическое изотермы адсорбции Ленгмюра, из которого мы рассчитаны термодинамические константы равновесия диссоциации (K D) и II) геометрический фактор, по существу мерой того, насколько бактериальных рецепторов пептида распределены на поверхность кантилевера. Поверхностного распределения рецепторов пептида (P) используется для исследования зависимости геометрии и лиганда загрузка. Показано, что пороговое значение р ~ 10% является критическим для зондирования. , Ниже которого нет обнаруживаемых сигнала при изгибе выше это значение, тем изгиб сигнала увеличивается почти линейно, показывая, что стресс является продуктом местного химического связывания факторовTor и геометрического фактора в сочетании механических подключения отреагировал регионов и предоставляет новую парадигму дизайна мощных агентов по борьбе с Superbug инфекций.

Изменения напряжения измеряют с использованием нано-точность, с беспрецедентной чувствительностью к одной Н-связи удаления, будет использоваться для отслеживания нарушений модели бактериальной клеточной стенки биомеханических в реальном времени (2а-г). Предел обнаружения наркотиков чувствительность для Ван был исследован последовательно разбавляя его концентрации в нескольких шагах от 1000 мкм до ≤ 10 нМ, 10 нМ выявления (~ 15 нг / мл), а самая низкая определяемая концентрация порождает в среднем ~ -9 ± 2 нм в виде дифференциального сигнала изгиба (рис. 2в). Способность обнаруживать антибиотиков в физиологических среда дополнительно исследовали в сыворотке крови в клинически значимых диапазоне концентраций 3-27 мкМ 17. После инъекции 7 мкМ Ван в сыворотке (90% фетальной телячьей сыворотки и 10% натрий-фосфатного буфера рН 7,4) во всех кантилеверов в идентичных условиях, дифференциальный сигналДала на сыворотке 105 ± 4 нм, а для консолей DLac покрытием, нет изгиба не наблюдалось (рис. 3). Значительного изгиба сигналов, наблюдаемых на DAla покрытием (восприимчивых к ванкомицину) кантилеверов вызванного сильным лекарственной мишень-связывающего взаимодействия. Однако для DLac покрытием (ванкомицину) консолей, наличие основного состояния отталкивания кислорода одинокая пара и снижение в связи NH ванкомицин связывающий карман 10,12 способствует ослаблению препарата-целевого взаимодействия связывания что приводит к меньшей или нет консольные не гибки, особенно для нижней ванкомицин концентрации (рис. 3). Однако для высокой концентрации ванкомицин, мы наблюдаем измеримых изгиба сигналы для DLac. Кроме того, наши экспериментальные дизайн важен для ссылок на месте, где все окntilevers покрыты обе DAla и DLac одновременно подвержены тем же аналита в реальном времени. Чтобы понять точную роль химии и геометрии, мы разработали модель 1 описывающий корреляцию между растворителем и поверхностных взаимодействий механики. Это создает поверхностное напряжение: <img alt="Уравнение 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> при р&gt; ПК и нуль в противном случае (1) Первое слагаемое в уравнении (1) является изотермы адсорбции Ленгмюра, что составляет наркотиками мишень-связывающим события и второй член виде степенного закона описывающая крупномасштабные последствия механического напряженного формирования сети. Постоянное соответствует максимальное напряжение поверхности, когда все доступные сайты связывания заняты и К D является поверхностью равновесной диссоциации минусыTANT на кантилевер. Анализа, как показано на рисунке 4 является результатом глобального фита уравнения (1) накладывается на измеренное дифференциальное выявление стрессовых сигналов; ~ 29,7 ± 1,0 и 14,1 ± 3,0 мН / м и К D ~ 1,0 ± 0,3 или 800 ± 310 мкМ для D-Ala или DLac пептидов, где соответствует мера поверхностное напряжение, когда все доступные сайты связывания заняты. Повышенная чувствительность консольных была настроена путем систематического изменения пептид р плотности при мониторинге стресс данные в зависимости от р при концентрации антибиотиков установлена ​​на 10, 100 и 250 мкм соответственно (рис. 5). Процесс повторяют со стрессом как функцию концентрации Ван в то время как пептид плотности зафиксирована на р ~ 100%. &lt;IMG Alt = &quot;Рисунок 1&quot; FO: Content-ширина = &quot;5 дюймов&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Рисунок 1. Консольные обнаружения антибиотиков поверхности связывающих взаимодействий. а) Схематическое представление массива консольные датчика и режим, при котором лекарственное средство-мишень взаимодействий обнаружено nanomechanically. б) Химическое связывание взаимодействие молекулы лекарственного средства (Van) и бактериальный аналоговый мукопептида (D-Ala или D-Lac). в) механизм, посредством которого мутировал ванкомицин подвержены бактериями (VSE) приобретает устойчивость к ванкомицину, удалив одну Н-связи в карман связывания. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Рисунок 2. Отслеживание нарушений модели клеточной стенки бактерий биомеханики в реальном времени. а) Абсолютные изгиба сигналы D-Ala, D-Lac и ПЭГ покрытием консолей в фосфатный буфер и 250 мкм ванкомицин. Дифференциальных сигналов ПЭГ ссылки приведены в черных линий. Б) Дифференциальное изгиба сигналы D-Ala и D-Lac покрытием консолей в фосфатном буфере и 250 мкМ ванкомицин. С) отклонения дифференциального кантилевера в зависимости от дозы сигнал как функцию времени в присутствии ванкомицин концентрациях порядка 10 нМ (желтая линия), 100 нм (красная линия) и 1000 нМ (темно-красная линия) соответственно. г) дифференциального отклонения кантилевера сигналы для трех D-Ala покрытием датчиков как консольные функции времени в присутствии 10нМ ванкомицин. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Рисунок 3. Отслеживание нарушений модели бактериальной клеточной стенки биомеханических в реальном времени для D-Ala и D-Lac покрытием консолей в присутствии 7 мкМ ванкомицин в фетальной сыворотки теленка. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Рисунок 4. Исследование наномеханики лекарственно-мишень взаимодействий. График, показывающий измеренного перепада поверхностного напряжения в ответ D-Ala (черные кружки) и D-Lac (красный кружки) покрытием консолей в зависимости от ванкомицинКонцентрация в растворе [Ван]. Данные, описываемой уравнением (1) (сплошные линии). 1 <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Рисунок 5. Оптимизация наномеханических чувствительность обнаружения рецептор-лиганд, исследуя зависимость нагрузки рецептор и геометрии с помощью смешанных монослоев. Измеренные дифференциальные поверхность реакции на стресс консольных датчиков в зависимости от D-Ala покрытия поверхности, стр. в присутствии фиксированной концентрации ванкомицина раствора при 10 мкМ (черная линия), 100 мкм (красная линия) и 250 мкм (зеленая линия).

Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Приобретенная устойчивость к антибиотикам является одной из основных проблем общественного здравоохранения и в настоящее время упорядоченных по ВОЗ в качестве одного из самых серьезных угроз для жизни человека. Здесь мы описываем использование консольной технологии для количественной антибактериальные сопротивление, критичных к открытию новых и мощных средств против полирезистентных бактерий.

Наномеханика лекарственно-целевого взаимодействия и антибактериальные обнаружения сопротивления

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Однодневный рабочий процесс Схема бактериальных патогенов обнаружения и антимикробной сопротивления из крови культур

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Новый метод для качественного многомасштабном анализа Бактериальный биопленок на нитчатых конидий с помощью конфокальной и электронной микроскопии

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

Надежный Пневмония Модель в иммунокомпетентных Грызуны для оценки антибактериальную эффективность против<i&gt; S. Пневмококк</i&gt;,<i&gt; H. гриппа</i&gt;,<i&gt; K. Пневмококк</i&gt;,<em&gt; P. палочки</em&gt; или<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Антибиотическая дерепликация с использованием платформы устойчивости к антибиотикам

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...