Name: live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread at JoVE.com

LWE og RK understøttes af det amerikanske National Institutes of Health tilskud R37 NS033506-16 og R01 NS060699-03. MPT blev støttet af et American Cancer Society postdoc Fellowship (PF-10-057-01-MPC). De råd og viden om Dr. Matthew Lyman og Dr. Oren Kobiler var medvirkende til at designe mikroskopet konfiguration og levende celle billeddiagnostiske metoder. Vi har også udvide tak til Neal Barlow og Brian T. Kain for Nikon Instruments for deres tekniske assistance ved køb, installation og performance af mikroskopet.

Afsnit 1 - miljøkontrol Betingelser for live-cell fluorescensmikroskopi <ol><li> 30 min forud for enhver imaging eksperiment tilslutte og begynde at varme mikroskopbordet top inkubator. <ol><li> Tænd mikroskop sendes og epifluorescerende lyskilder, og automatiserede hardware kontrol. Åbn mikroskop kontrol software, NIS Elements, til at forbinde til mikroskopet og begynde køling EM-CCD-kameraet. </li><li> Vedhæft Lens varmere til passende mål (enten 60X eller 100X olieimmersion) Bemærk:. Vælg o...

<ol>
	<li>Johnson, D. C., Baines, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+remodel+host+membranes+for+virus+egress.">Herpesviruses remodel host membranes for virus egress.</a> Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).</li><li>Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+assembly:+a+tale+of+two+membranes.">Herpesvirus assembly: a tale of two membranes.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).</li><li>Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+accumulation,+envelopment,+and+exit+in+growth+cones+and+varicosities+in+mid-distal+regions+of+axons.">Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).</li><li>Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+Simplex+Virus+Capsids+Are+Transported+in+Neuronal+Axons+without+an+Envelope+Containing+the+Viral+Glycoproteins.">Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).</li><li>Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+gE/gI+and+US9+proteins+promote+transport+of+both+capsids+and+virion+glycoproteins+in+neuronal+axons.">Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons.</a> Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).</li><li>Tomishima, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins.">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+case:+Married+versus+Separate+models+of+alphaherpes+virus+anterograde+transport+in+axons.">Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons.</a> Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).</li><li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+herpesvirus+trafficking+in+neurons:+membrane+acquisition+directs+motion.">Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).</li><li>Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+a+fluorescent+tegument+component+in+single+pseudorabies+virus+virions+and+enveloped+axonal+assemblies.">Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies.</a> Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).</li><li>Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+an+alphaherpesvirus+membrane+protein+that+is+essential+for+anterograde+axonal+spread+of+infection+in+neurons.">Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons.</a> mBio. 3 (2), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+axon-to-cell+spread+involves+limited+virion+transmission.">Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+replication+compartments+originate+with+single+incoming+viral+genomes.">Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes.</a> mBio. 2 (6), (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection.">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).</li><li>Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuron+cultures+for+directional+infection+by+alpha+herpesviruses.">Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).</li><li>Zareen, N., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+culturing+sympathetic+neurons+from+rat+superior+cervical+ganglia+(SCG).">Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG).</a> J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).</li><li>Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-Cell+Spread+of+Pseudorabies+Virus+in+a+Compartmented+Neuronal+Culture+System.">Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System.</a> Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).</li><li>Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+compartmented+cultures+of+rat+sympathetic+neurons.">Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).</li><li>Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+Mediates+Axonal+Sorting+and+Directional+Transport+of+Alphaherpesvirus+Particles+in+Neurons.">Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons.</a> Cell Host &amp; Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast-axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).</li><li>Kramer, T., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+Infection+Disrupts+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).</li><li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+Hippocampal+Neurons+in+Culture.">Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li></ol>

Målet med levende celler er at observere biologiske processer, som de opstår, uden signifikant ændring af loven for observation. Dette mål opnås ved at optimere tre variabler: miljøkontrol, hastighed billedbehandling og fluorescens belysning. Disse indbyrdes afhængige variable skal afbalanceres for at opnå levedygtige billeddannelse forhold. De præsenterede protokoller udnytte særlige betingelser til at producere de repræsentative resultater. Vi vil kort diskutere miljøkontrol og observationelle skader, før...

Infektion af det perifere nervesystem (PNS) efter alphaherpes vira, såsom herpes simplex virus (HSV) -1, -2 og pseudorabies virus (PRV) involverer flere indviklede og stærkt reguleret trin hele den virale livscyklus. Transport indenfor neuroner i PNS er kritisk under begivenhederne i både primær virusinfektion og efterfølgende inter-host spredes. De molekylære mekanismer, der modulerer to komponenter af den virale livscyklus, instrueret transport af virale forsamlinger væk fra celle organer inden axoner (anterograd transport) og efterfølgende overførsel af virioner til modtagelige celler (anterograd spread) er vigtige for forståelsen herpesvirus patogenese. Transporten og påstigning af virale partikler i neuroner er afhængig af montering af en moden infektiøs virion 1,2. Forud fastsatte assays, herunder immunofluorescens (IF) og elektronmikroskopi (EM), blev anvendt til at undersøge partikel forsamling tilstand og protein interaktioner forbundet med virion transport og spredning 3-6. Men den dynamiske karakter af transport virioner og eksperimentelle artefakter indført ved kemisk fiksering forvirret fortolkningen af faste billeder 7,8. For nylig har en række viral-fluorescerende fusionsproteiner er beskrevet for HSV og PRV der har ubetydelige konsekvenser for protein-funktion. Grønt fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende proteiner (mCherry eller mRFP) fluoroforer er ofte parret til at tillade billeddannelse af to af de tre strukturelle komponenter af en moden virion: capsid, avner, og glycoprotein 9-11. Levende cell imaging af anterograd transport ved hjælp dual-mærkede virus visualiserer samling tilstand af virale partikler under transport. Lignende fluorofor udtrykker virale stammer anvendes til at visualisere antallet og mangfoldigheden af virale genomer efter spredning 12,13. Egenskaberne af de fluorescerende proteiner (gennemgået i 14,15) i høj grad indflydelseevnen til at visualisere virale eller cellulære enheder. De iboende egenskaber fluorescerende protein, herunder selvstændige-interaktioner og stabilitet, bør overvejes, når designe og teste nye proteinfusioner for bevarelsen af ​​vildtype funktionalitet. I forbindelse med fluorescerende proteinfusioner, to velkarakteriserede in vitro-cellekultur-systemer anvendes til levende celler af herpes virus infektion: dissocieret 16 og opdelte 17 (figur 1A) rotte overlegen cervikale ganglier (SCG) neuroner. I begge systemer er embryonale SCG s dissekeret, dissocieret til enkelte celle organer og forgyldt til in vitro dyrkning 18.. SCG neuroner er en del af det autonome nervesystem og kan let dyrkes og differentieret ved neuronal vækstfaktor (NGF) i en moden polariserede tilstand ex vivo. Dissocierede SCG neuroner danner et omfattende netværk af axoner, der tillader feller visualisering af viruspartikler, som de gennemgår anterograd transport 6.. Opdelte SCG kulturer giver fluidisk isolation af nervecelle kroppen (S-rum) og distale Axon Termini (N rum) 19. En række detaljerede protokoller for konstruktion og brug af opdelte neuroner anvender originale 20 eller modificeret Campenot kamre 17 er blevet offentliggjort tidligere. Fluidic isolation giver mulighed for selektiv infektion af neuronale celle organer og påvisning af afkom virioner efter transport til isolerede Axon Termini. Plating epitelceller over terminalerne før infektion giver recipientceller til spredning af virusinfektion. Der er mange væsentlige elementer er vigtige for alle levende cell imaging eksperimenter, men den mest relevante for vores protokoller er: automatiseret billede erhvervelse, fluorescerende belysning, hastighed billedbehandling og miljøkontrol. For alle billeddiagnostiske eksperimenter, bruger vien omvendt, automatiseret, epifluorescens belysning mikroskop (figur 1B). Mikroskopet er bygget op omkring Nikon Eclipse Ti base og beskæftiger en række computer kontrollerede motoriserede systemer til hurtigt at omkonfigurere mikroskopet under automatiseret billede erhvervelse. For fluorescensbelysning, bruger vi et bredspektret kviksølv buelampe der kan dæmpes med neutralfiltre langs belysningen sti. Excitationsfiltre begrænser spektret af fluorescerende belysning og når parret med multi-pass dikroiske spejle og fluorescensemission filtre visualisere specifikke fluorescerende forbindelser. Excitation og emission filtre er monteret i selvstændige, hurtige skift filter hjul til at muliggøre en hurtig sekventiel køb af forskellige fluorescerende kanaler. Hastigheden af ​​billedet erhvervelse er yderligere forbedret med en følsom og hurtig EM-CCD-kamera, nyttig til påvisning af lav intensitet signaler og kort image Læs tider. Miljøkontrol på MicroscOPE opnås med en scene top opvarmet inkubator og en objektivlinse varmelegeme at opretholde prøver ved forhøjede temperaturer, mens en befugtet og CO 2-beriget atmosfære ledes ind i inkubatoren. Mikroskopet er holdt i et mørkt rum med omgivelsestemperatur vedligeholdt tæt ved 25 ° C og uden lys minimeres med mørklægningsgardiner på alle vinduer. Følgende protokoller beskriver anvendelsen af ​​dette system til anterograd transport og spredning assays. En række alternativer til kontrol for variablerne i levende celler. Styringen af ​​mikroskopi indstillinger kan udføres manuelt eller via automatiserede systemer er afhængige af proprietær software. Fluorescensbelysning kan opnås med halogen, LED eller laser kilder. Hastigheden af ​​billeddannelse er modificeret ved hastigheden af ​​filteret kobling og tid til at visualisere signalet med den parrede detektionssystemet. Miljøkontrol kan opnås med specialiseret hardware på mistativet fase, indkapsling af hele eller en del af mikroskopet i en opvarmet og befugtet kasse, eller ved at hæve temperaturen i det rum, hvor mikroskopi vil blive udført. Hver af disse alternativer har fordele og ulemper i forbindelse med pris og ydelse. I den efterfølgende protokol, detalje vi brug af levende celler for at studere hurtig anterograd transport og anterograd spredning af alphaherpes virus gennem brug af rekombinante virusstammer. Realtid levende celler visualiserer capsid, avner, og / eller glycoprotein co-lokalisering af dynamiske strukturer undergår transport inden axoner 11.. Overnight timelapse billeddannelse af opdelte neuronkulturer visualiserer axonal virion udgang og infektion modtagelige celler 12. Protokollerne præsenteres her, er blevet optimeret til brug med vores særlige imaging system, men præsenteres i brede vendinger i forhold til de fire elementer i levende celler. I den diskussion, vivil nærmere nogle af optimeringen, der er nødvendig for en vellykket forsøg.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Fremskridt i levende celler fluorescens mikroskopi teknikker, samt opførelse af rekombinante virale stammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner har aktiveret real-time visualisering af transport og spredning af alphaherpes virusinfektion af neuroner. Nytten af ​​nye fluorescerende fusionsproteiner til viral membran, avner, og capsider, sammenholdt med levende celler, identificerede virale partikel forsamlinger gennemgår transport inden axoner. Lignende værktøjer er med held blevet anvendt til analyser af celle-celle spredning af virale partikler at kvantificere antallet og mangfoldigheden af ​​virioner overføres mellem cellerne. Vigtigere er det, de teknikker levende celler af anterograd transport og spredning producere et væld af oplysninger, herunder partikel transport hastigheder, fordelinger af partikler, og tidsmæssige analyser af protein lokalisering. Sideløbende klassiske virale genetiske teknikker, har disse metoder, forudsat kritiske indsigteri vigtige mekanistiske spørgsmål. I denne artikel beskriver vi i detaljer billeddiagnostiske metoder, der blev udviklet til at besvare grundlæggende spørgsmål om alphaherpes virus transport og spredning.

Anterograd Transport Anvendelsen af denne protokol til infektioner af dissocierede SCG kulturer med PRV 348 har en rekombinant PRV-stammen udtrykker GFP-US9 og GM-mCherry membranfusionsteknikker proteiner lettet visualisering af anterograd transport af virioner (figur 3 og supplerende Movie 4). Indarbejdelsen af ​​disse fusionsproteiner i viruspartikler resultater i deres opdagelse på at transportere puncta og de førnævnte imaging betingelserne minimere ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread at JoVE.com

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Levende cell imaging af alphaherpes virusinfektioner muliggør analyse af dynamiske begivenheder rettet transport og intercellulære spredning. Her præsenteres metoder, der udnytter rekombinante virale stammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner at lette visualisering af virale samlinger under infektion af primære neuroner.

Levende Cell Imaging af Alphaherpes Virus Anterograd Transport og Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering af effekt og toksicitet af RNA Målretning HIV-1 Produktion til brug i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging celle interaktion i trakeal slimhinde under Influenza virusinfektion ved hjælp af to-foton Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA test til vurdering af rabiesvaccine potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

En luciferase-fluorescerende reporter influenza virus til levende billeddannelse og kvantificering af viral infektion

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital Widefield Fluorescens Mikroskopi af lungemikrocirkulation ved eksperimentel akut lungeskade ved hjælp af et vakuumstabiliseret billeddannelsessystem

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Live-billeddannelse i realtid af regenerering af musens submandibulære kirtel

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Forfatter Spotlight: Undersøgelse af makrofag-epitelcelleinteraktioner i spytkirtelregenerering efter skade 

Forhør af celle-celle-interaktioner i spytkirtlen via ex vivo levende cellebilleddannelse

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...