Name: live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread at JoVE.com

LWE et RK sont pris en charge par le US National Institutes of Health des subventions R37 NS033506-16 et R01-03 NS060699 nationale. MPT a été pris en charge par une société de bourse de recherche postdoctorale American Cancer (PF-10-057-01-MPC). Les conseils et les connaissances du Dr Matthew Lyman et le Dr Oren Kobiler ont joué un rôle dans la conception de la configuration du microscope et les méthodes d&#39;imagerie des cellules vivantes. Nous remercions également pour Neal Barlow et Brian T. Kain de Nikon Instruments pour leur assistance technique dans l&#39;acquisition, l&#39;installation et la performance du microscope.

Section 1 - Conditions de contrôle de l&#39;environnement pour la microscopie par fluorescence des cellules vivantes <ol><li> 30 min avant toute expérience d&#39;imagerie connecter et commencer à chauffer le microscope étage supérieur incubateur. <ol><li> Allumez le microscope, les sources de lumière transmise et épifluorescent, et les commandes de matériels automatisés. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope, NIS Elements, pour se connecter au microscope et commencer à refroidir l&#39;appareil EM-CCD...

<ol>
	<li>Johnson, D. C., Baines, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+remodel+host+membranes+for+virus+egress.">Herpesviruses remodel host membranes for virus egress.</a> Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).</li><li>Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+assembly:+a+tale+of+two+membranes.">Herpesvirus assembly: a tale of two membranes.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).</li><li>Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+accumulation,+envelopment,+and+exit+in+growth+cones+and+varicosities+in+mid-distal+regions+of+axons.">Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).</li><li>Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+Simplex+Virus+Capsids+Are+Transported+in+Neuronal+Axons+without+an+Envelope+Containing+the+Viral+Glycoproteins.">Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).</li><li>Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+gE/gI+and+US9+proteins+promote+transport+of+both+capsids+and+virion+glycoproteins+in+neuronal+axons.">Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons.</a> Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).</li><li>Tomishima, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins.">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+case:+Married+versus+Separate+models+of+alphaherpes+virus+anterograde+transport+in+axons.">Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons.</a> Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).</li><li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+herpesvirus+trafficking+in+neurons:+membrane+acquisition+directs+motion.">Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).</li><li>Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+a+fluorescent+tegument+component+in+single+pseudorabies+virus+virions+and+enveloped+axonal+assemblies.">Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies.</a> Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).</li><li>Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+an+alphaherpesvirus+membrane+protein+that+is+essential+for+anterograde+axonal+spread+of+infection+in+neurons.">Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons.</a> mBio. 3 (2), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+axon-to-cell+spread+involves+limited+virion+transmission.">Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+replication+compartments+originate+with+single+incoming+viral+genomes.">Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes.</a> mBio. 2 (6), (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection.">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).</li><li>Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuron+cultures+for+directional+infection+by+alpha+herpesviruses.">Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).</li><li>Zareen, N., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+culturing+sympathetic+neurons+from+rat+superior+cervical+ganglia+(SCG).">Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG).</a> J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).</li><li>Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-Cell+Spread+of+Pseudorabies+Virus+in+a+Compartmented+Neuronal+Culture+System.">Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System.</a> Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).</li><li>Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+compartmented+cultures+of+rat+sympathetic+neurons.">Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).</li><li>Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+Mediates+Axonal+Sorting+and+Directional+Transport+of+Alphaherpesvirus+Particles+in+Neurons.">Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons.</a> Cell Host &amp; Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast-axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).</li><li>Kramer, T., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+Infection+Disrupts+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).</li><li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+Hippocampal+Neurons+in+Culture.">Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li></ol>

Le but de l&#39;imagerie des cellules vivantes est l&#39;observation des processus biologiques tels qu&#39;ils se présentent sans altération significative par l&#39;acte d&#39;observation. Cet objectif est atteint par l&#39;optimisation de trois variables: le contrôle de l&#39;environnement, de la vitesse de l&#39;imagerie et l&#39;éclairage par fluorescence. Ces variables interdépendantes doivent être équilibrées pour obtenir des conditions d&#39;imagerie viables. Les protocoles présentés utilisent des condit...

Infection du système nerveux périphérique (SNP) par alphaherpes virus tels que le virus de l&#39;herpès simplex (HSV) -1, -2 et virus de la pseudo-rage (PRV) comporte plusieurs étapes complexes et fortement réglementés au long du cycle de vie du virus. Transport dans les neurones du SNP est essentiel pendant les événements des deux infection virale primaire et la suite propagation inter-hôte. Les mécanismes moléculaires qui modulent deux composantes du cycle de vie du virus, le transport dirigé des assemblées virales loin des corps cellulaires dans les axones (transport antérograde) et de la transmission ultérieure des virions aux cellules sensibles (propagation antérograde) sont importantes pour comprendre la pathogenèse herpèsvirus. Le transport et l&#39;évacuation des particules virales dans les neurones dépend de l&#39;assemblage d&#39;un 1,2 virion infectieux mature. Dosages préalablement fixés, y compris immunofluorescence (IF) et la microscopie électronique (EM), ont été utilisés pour étudier l&#39;état de l&#39;ensemble des particules et protinteractions ein associés au transport du virion et la propagation 3-6. Toutefois, la nature dynamique des virions transport et des artefacts expérimentaux mis en place par fixation chimique confondu l&#39;interprétation des images fixes 7,8. Récemment, un certain nombre de protéines de fusion virale fluorescentes ont été décrits pour le HSV et PRV qui ont des répercussions négligeables sur la fonction des protéines. Green Fluorescent Protein (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (mCherry ou mRFP) fluorophores sont souvent jumelés pour permettre l&#39;imagerie de deux des trois composantes structurelles d&#39;un virion maturité: capside, tégument, et la glycoprotéine 9-11. Vivez l&#39;imagerie cellulaire du transport antérograde utilisant des virus à double marquage visualise l&#39;état d&#39;assemblage des particules virales durant le transport. Fluorophore similaire exprimant souches virales sont utilisés pour visualiser le nombre et la diversité des génomes viraux suivants propagation 12,13. Les propriétés des protéines fluorescentes (revue de 14,15) influent considérablement surla capacité de visualiser assemblées virales ou cellulaires. Les propriétés intrinsèques de la protéine fluorescente, y compris l&#39;auto-interactions et la stabilité, devraient être considérés lors de la conception et de tester de nouvelles protéines de fusion pour la préservation de la fonctionnalité de type sauvage. En conjonction avec des protéines de fusion fluorescentes, deux bien caractérisés dans les systèmes de culture cellulaire in vitro sont utilisés pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de l&#39;infection par le virus de l&#39;herpès: dissocié 16 et compartimenté 17 (figure 1A) ganglions neurones cervicaux supérieurs de rat (CTB). Dans les deux systèmes, embryonnaire SCG de sont disséqués, dissocié à des organismes unicellulaires, et plaqué par culture in vitro 18. SCG neurones font partie du système nerveux autonome et peut être facilement cultivées et différenciées par le facteur de croissance neuronal (NGF) dans un état ​​polarisé matures ex vivo. Neurones SCG dissociées forment un réseau étendu d&#39;axones qui permet fou la visualisation de particules virales car ils subissent le transport antérograde 6. SCG cultures compartimentées offrent une isolation fluidique du corps cellulaire des neurones (S compartiment) et terminaisons axonales distales (compartiment N) 19. Un certain nombre de protocoles détaillés pour la construction et l&#39;utilisation des neurones compartimentées aide initiale de 20 ou modifié Campenot chambres 17 ont été publiés précédemment. Isolement fluidique permet d&#39;infection sélective des corps cellulaires neuronaux et la détection des virions fils après le transport de la gare Termini de l&#39;axone isolés. Placage cellules épithéliales sur les terminaisons avant l&#39;infection fournit des cellules réceptrices de la propagation de l&#39;infection virale. Il ya beaucoup d&#39;éléments essentiels importants pour tous vivent expérimentation d&#39;imagerie cellulaire, mais le plus pertinent pour nos protocoles sont les suivants: acquisition automatique de l&#39;image, éclairage fluorescent, la vitesse de l&#39;imagerie et le contrôle de l&#39;environnement. Pour toutes les expériences d&#39;imagerie, nous utilisonsinversé, automatisé, microscope d&#39;éclairage à épifluorescence (figure 1B). Le microscope est construit autour du Nikon Eclipse base de Ti et emploie un certain nombre de systèmes motorisés commandés par ordinateur pour reconfigurer rapidement le microscope lors de l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Pour l&#39;éclairage par fluorescence, nous utilisons un large spectre mercure lampe à arc qui peut être atténué avec des filtres de densité neutre le long de la voie d&#39;éclairage. filtres d&#39;excitation limiter le spectre de l&#39;éclairage fluorescent et lorsqu&#39;il est associé à des miroirs dichroïques multi-pass et filtres d&#39;émission de fluorescence visualiser composés fluorescents spécifiques. Les filtres d&#39;excitation et d&#39;émission sont montés à commutation rapide roues indépendantes, le filtre pour permettre l&#39;acquisition séquentielle rapide des différents canaux fluorescents. La vitesse d&#39;acquisition des images est encore améliorée avec une caméra EM-CCD sensible et rapide, utile pour la détection des signaux de faible intensité et de courte images fois lu. Contrôle de l&#39;environnement sur la microscOPE est réalisée avec un haut stade chauffé incubateur et un chauffage de l&#39;objectif de maintenir les échantillons à des températures élevées pendant une atmosphère humidifiée 2 et CO enrichi est passé dans l&#39;incubateur. Le microscope est gardé dans une pièce sombre avec une température ambiante maintenue à près de 25 ° C et la lumière extérieure réduite avec des rideaux occultants sur toutes les fenêtres. Les protocoles suivants décrivent l&#39;utilisation de ce système pour le transport antérograde et des essais d&#39;étalement. Un certain nombre d&#39;alternatives existent pour contrôler les variables d&#39;imagerie des cellules vivantes. Le contrôle des paramètres de microscopie peut être effectuée manuellement ou par des systèmes automatisés qui dépendent de logiciels propriétaires. Éclairage par fluorescence peut être réalisé avec des sources laser halogène, LED ou. La vitesse de formation d&#39;image est modifiée par la vitesse de commutation du filtre et le temps pour visualiser le signal dans le système de détection couplé. Contrôle de l&#39;environnement peut être réalisé avec du matériel spécialisé sur la miétape de croscope, enceinte de tout ou partie du microscope dans une boîte chauffé et humidifié, ou en élevant la température de la pièce où microscopie sera effectuée. Chacune de ces alternatives a ses avantages et inconvénients liés aux coûts et à la performance. Dans le protocole suivant, nous détaillons l&#39;utilisation de l&#39;imagerie des cellules vivantes pour étudier le transport antérograde rapide et la propagation antérograde de alphaherpes virus grâce à l&#39;utilisation de souches virales recombinantes. Imagerie des cellules vivantes en temps réel visualise capside, tégument et / ou glycoprotéine co-localisation des structures dynamiques qui subissent le transport dans les axones 11. Imagerie timelapse nuit de cultures de neurones compartimentées visualise sortie du virion axonale et l&#39;infection de cellules sensibles 12. Les protocoles présentés ici ont été optimisés pour une utilisation avec notre système d&#39;imagerie en particulier, mais sont présentés en termes généraux par rapport aux quatre éléments d&#39;imagerie des cellules vivantes. Dans la discussion que nousseront plus en détail certains de l&#39;optimisation qui est nécessaire pour l&#39;expérimentation réussie.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Les progrès des techniques vivantes des cellules par microscopie de fluorescence, ainsi que la construction de souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes ont permis la visualisation en temps réel du transport et de la propagation de l&#39;infection par le virus alphaherpes des neurones. L&#39;utilité de nouvelles protéines de fusion fluorescentes à membrane virale, tégument, et capsides, en conjonction avec l&#39;imagerie des cellules vivantes, identifié ensembles de particules virales subissant transport à l&#39;intérieur des axones. Des outils similaires ont été utilisées avec succès pour les analyses de cellule à cellule propagation de particules virales de quantifier le nombre et la diversité des virions transmis entre les cellules. Surtout, les techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes du transport antérograde et la propagation de produire une foule de renseignements, y compris des vitesses de particules de transport, de distribution de particules, et des analyses temporelles de la localisation des protéines. A côté des techniques génétiques virales classiques, ces méthodes ont fourni des renseignements cruciauxen questions mécanistiques importantes. Dans cet article, nous décrivons en détail les méthodes d&#39;imagerie qui ont été développés pour répondre aux questions de base du transport de virus alphaherpes et la propagation.

Transport antérograde L&#39;application de ce protocole d&#39;infections des cultures SCG dissociées avec PRV 348, une souche PRV recombinant exprimant la GFP-US9 et des protéines de fusion membranaire gM mCherry, a facilité la visualisation du transport antérograde des virions (Figure 3 et Movie supplémentaires 4). L&#39;incorporation de ces protéines de fusion dans des particules virales résultats dans leur détection sur le transport lacrymaux, et le...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Imagerie des cellules vivantes d&#39;infections virales alphaherpes permet d&#39;analyser les événements dynamiques de transport dirigée et la propagation intercellulaire. Ici, nous présentons des méthodes qui utilisent des souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes pour faciliter la visualisation des assemblages virale lors d&#39;une infection de neurones primaires.

Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

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JoVE Journal

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