Name: fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00
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Nous remercions Asya Smirnov et Laura Gonyar pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R00 R01 TW008042 et AI097312 à AKCMBJ a été soutenu en partie par les NIH T32 AI007046.

Une. Évaluation de la viabilité bactérienne avec l&#39;iodure de propidium et SYTO9 <ol><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries d&#39;intérêt. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois doucement dans 0,1 M de 3 - (N-morpholino) propanesulfonique (MOPS), pH 7,2, contenant 1 mM de MgCl2 (MOPS / MgCl 2).<...

<ol>
	<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77 (2011).</li><li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes.">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li><li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay.">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li><li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).</li><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions.">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+absolute,+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer.">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li><li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization.">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128,+a+fresh-produce+washing+aid,+in+chlorinated+wash+solutions.">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li><li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils.">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells:+clinical+and+pathogenetic+implications.">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li><li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li><li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection.">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53 (2006).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination:+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages.">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro.">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li><li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells.">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li><li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR.">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li><li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells.">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li><li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages.">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li><li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate,+Tetrahymena+sp.">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li><li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae:+the+requirement+for+hypoxanthine.">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils.">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li><li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain.">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li></ol>

Présentés ici sont deux protocoles qui utilisent liaison à l&#39;ADN et les colorants de viabilité en conjonction avec une lectine fluorescente pour identifier les bactéries vivantes et mortes et attachés à l&#39;intérieur des cellules humaines. Depuis deux protocoles pénalisent en direct de bactéries mortes, le choix de protocole à utiliser dépend du but de l&#39;expérience. Le premier protocole utilise l&#39;iodure de propidium pour détecter les bactéries non viables et SYTO9 pour détecter les bactéri...

Il existe une interaction dynamique et co-évolution entre les bactéries et les hôtes où ils résident. Les bactéries ont évolué organelles d&#39;adhérence, des systèmes de sécrétion, et / ou la capacité de produire des toxines qui permettent leur infection productive de phagocytose de l&#39;hôte et des cellules non phagocytaires. Les bactéries doivent également composer avec la reconnaissance et l&#39;activité antimicrobienne du système immunitaire de l&#39;hôte. Le système immunitaire de l&#39;hôte est constitué de composants innée et adaptative, y compris des barrières physiques et chimiques, les cellules du système immunitaire, le système du complément et d&#39;autres composants de l&#39;immunité humorale. Alors que de nombreuses bactéries sont sensibles à la destruction et à un dégagement de la réponse de l&#39;hôte immunisé à couches multiples, certaines bactéries pathogènes et opportunistes ont développé des mécanismes d&#39;infecter une variété de cellules hôtes et de dénaturer un dégagement de l&#39;hôte immunisé réponse 1. Neisseria gonorrhoeae est un exemple d&#39;un agent pathogène bactérien qui est très adapté à persister dans son hôte humain. N. gonorrhoeae colonise rapidement les surfaces luminales de cellules épithéliales de la muqueuse du tractus urogénital, du pharynx, de la conjonctive, et le rectum. Colonisation déclenche le recrutement abondant des neutrophiles au niveau des muqueuses. Les neutrophiles sont des phagocytes professionnels qui possèdent une variété de procédés antimicrobiens pour tuer les micro-organismes, mais N. gonorrhoeae est capable de survivre en présence de neutrophiles 5.2. Comprendre comment les bactéries pathogènes telles que N. gonorrhoeae subvertir, supprimer, et détourner la réponse immunitaire à survivre finalement dans des environnements d&#39;accueil normalement hostiles est cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses. Les protocoles expérimentaux souvent utilisés pour étudier la survie des bactéries dans les cellules hôtes comprennent des dosages de comptage de colonies, des essais de protection de la gentamicine, et la microscopie électronique. Dans les dosages de comptage de colonies, une population de cellules infectées est lysé (par exemple, avec un détergent à WHich les bactéries sont résistantes) pour libérer les bactéries. Les lysats sont dilués et étalés sur des milieux à base d&#39;agar-agar-, et des unités formant des colonies dans les lysats sont énumérées pour chaque point de temps et / ou d&#39;une condition expérimentale. Cette approche rend compte de la viabilité de l&#39;ensemble de la population bactérienne, mais n&#39;est pas capable de faire la différence entre la survie intracellulaire et extracellulaire. Une variante de l&#39;essai de comptage de colonies, l&#39;essai de protection de la gentamicine, la mesure spécifiquement la survie bactérienne intracellulaire, sur la base de l&#39;incapacité des antibiotiques gentamicine à traverser la membrane plasmique eucaryote 6. Toutefois, ce dosage est dépendant de la bactérie étant sensible à la destruction par la gentamicine (ou un autre antibiotique qui est similaire à la membrane eucaryote impermeant) et l&#39;incapacité de l&#39;antibiotique d&#39;avoir accès à des bactéries internes. Par conséquent, un test de protection de la gentamicine peut ne pas être efficace pour l&#39;examen de toutes les espèces bactériennes ou lors de l&#39;examen survie bactérienne dans trèspinocytaire cellules telles que les neutrophiles. Aucune de ces approches révèle la localisation subcellulaire ou tout autre comportement de bactéries individuelles (par exemple, si les bactéries forment des agrégats ou microcolonies qui se comportent différemment à partir de cellules bactériennes individuelles). Une autre approche fréquemment utilisé pour examiner la viabilité des bactéries externes et internes individuelles est la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM). Cette approche est avantageuse en ce qu&#39;elle peut fournir des informations concernant l&#39;emplacement de la bactérie dans les cellules hôtes (par exemple phagosome, cytoplasme, autophagosome), qui peut être davantage étudiée par microscopie immuno-électronique avec des anticorps d&#39;or couplés à des marqueurs contre subcellulaires. Cependant, la microscopie électronique n&#39;est pas particulièrement sensible à l&#39;évaluation de la viabilité bactérienne. Lorsque les sections sont colorées incorporées à l&#39;acétate d&#39;uranyle, le citrate de plomb, ou d&#39;autres réactifs denses aux électrons et imagées par microscopie électronique, les bactéries denses aux électrons sont considérés comme viable et electron-lucent non viable 7,8. Toutefois, cette hypothèse surestime la viabilité bactérienne, puisque seuls les bactéries mortes avec des membranes gravement perturbés et dépourvu de cytoplasme semble électron-Lucent. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter une gamme de densités d&#39;électrons en fonction de leur stade de croissance, ce qui rend difficile la détermination de la viabilité. Comme alternative ou en plus de ces procédés couramment utilisés, nous fournissons ici les protocoles et les raisons de l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui indiquent la viabilité bactérienne afin d&#39;évaluer la survie des bactéries fixées à et internalisées par des cellules hôtes. Pour identifier les bactéries extracellulaires, les cellules infectées sont d&#39;abord exposés à un réactif fluorescent, tel que la lectine ou un anticorps spécifique de bactéries. Les cellules infectées sont ensuite perméabilisées et exposés à des colorants spécifiques à l&#39;ADN qui sont accessibles aux bactéries de façon différentielle avec des membranes intactes vs dégradés, comme substitut de la viabilité bactérienne. Dans la première protocol, la membrane perméable SYTO9 de colorant identifie la population bactérienne totale, tandis que l&#39;iodure de propidium est uniquement accessible aux bactéries qui ont compromis les membranes et sont donc considérés comme non viable. L&#39;iodure de propidium et SYTO9 ont été utilisées pour évaluer la viabilité bactérienne dans les biofilms, discrimination pathogène à partir de bactéries non pathogènes, et énumérer les bactéries d&#39;origine hydrique viables 9-12. Dans le second protocole, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phénylindole (DAPI) identifie les bactéries totales, tandis que SYTOX vert est uniquement accessible à la population non viable. Ces paires viabilité de colorants peuvent être combinés avec immunofluorescence pour déterminer l&#39;emplacement de chaque bactérie par rapport à une protéine d&#39;intérêt, par exemple pour définir la localisation sous-cellulaire bactérienne. L&#39;utilisation de ces tests donne un aperçu de la clé dans les interactions qui résultent en la destruction des bactéries ou de la survie au cours de l&#39;infection de cellules hôtes. Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés pour évaluer la viabilité deN. gonorrhoeae qui est fixée à l&#39;intérieur et les neutrophiles humains primaires, y compris dans les différentes populations de neutrophiles 5,13,14 phagosomes. Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la viabilité de bactéries gram-positives et gram-négatives dans les phagocytes professionnels, des phagocytes non-professionnels, des protozoaires et des 15 à 24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Les protocoles actuels pour répondre à ces questions comprennent des essais de comptage des colonies, des essais de protection gentamicine, et la microscopie électronique. le nombre de colonies et de protection de la gentamicine essais seulement évaluer la viabilité de l&#39;ensemble de la population bactérienne et sont incapables de déterminer la viabilité bactérienne individu. La microscopie électronique peut être utilisé pour déterminer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations en ce qui concerne leur localisation dans les cellules hôtes. Cependant, les bactéries présentent souvent une gamme de densités d&#39;électrons, ce qui rend difficile l&#39;évaluation de la viabilité. Cet article décrit les protocoles pour l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l&#39;intérieur et associés à des cellules hôtes. Ces tests ont été développés à l&#39;origine pour évaluer la survie de Neisseria gonorrhoeae dans les neutrophiles humains primaires, mais doit être unpplicable toute interaction cellulaire bactérie-hôte. Ces protocoles associent des colorants fluorescents membrane perméable (SYTO9 et 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), qui colore toutes les bactéries, avec des colorants de membrane imperméable fluorescent (iodure de propidium et SYTOX vert), qui ne sont accessibles à bactéries non viables. Avant la perméabilisation de la cellule eucaryote, d&#39;un anticorps ou d&#39;un réactif fluorescent est ajouté à identifier les bactéries extracellulaires. Ainsi, ces tests de discrimination de la viabilité des bactéries adhérentes et à l&#39;intérieur des cellules eucaryotes. Un protocole est également prévue en utilisant les colorants de viabilité en combinaison avec des anticorps fluorescents à des marqueurs de cellules eucaryotes, afin de déterminer la localisation subcellulaire des bactéries individuelles. Les colorants de viabilité bactériennes décrites dans cet article sont un complément et / ou solution de rechange adaptée à des techniques de microbiologie traditionnelle pour évaluer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations sur l&#39;endroit où les bactéries survivent dans une cellule hôtes.

Les protocoles décrits ont été utilisés pour examiner la survie de N. gonorrhoeae après l&#39;exposition à l&#39;humain primaire neutrophiles 5,26. Les neutrophiles ont été infectées par N. gonorrhoeae et traitées avec le protocole 1, en ​​utilisant la viabilité SYTO9 colorant vert fluorescent et de l&#39;iodure de propidium-rouge fluorescent (figure 4A). Les colorants ont été ajoutés en présence de saponine, qui séquestre le cholestérol pour perméabili...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l&#39;intérieur et associés à des cellules hôtes.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recherche

Immunologie et infection

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Utilisation de la cytométrie d&#39;image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Électroporation d&#39;effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules mammifères

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...