Name: fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00
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私たちは、原稿の重要な読書のためにアシャスミルノフとローラGonyarに感謝します。この作品は、NIH T32 AI007046によって部分的にサポートされていましたAKCMBJへの助成金NIHのR00 TW008042とR01 AI097312によってサポートされていました。

1。ヨウ化プロピジウムとSYTO9と細菌の生存率を評価する<ol><li>目的の細菌で24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li>一旦穏やかで細胞をすすぎ、0.1M 3 - （N-モルホリノ）、1mMのMgCl 2（MOPS /のMgCl 2）を含有するプロパンスルホン酸（MOPS）、pH7.2で?...

<ol>
	<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77 (2011).</li><li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes.">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li><li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay.">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li><li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).</li><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions.">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+absolute,+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer.">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li><li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization.">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128,+a+fresh-produce+washing+aid,+in+chlorinated+wash+solutions.">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li><li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry:+a+comparison+to+culture-based+techniques.">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).</li><li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils.">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells:+clinical+and+pathogenetic+implications.">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li><li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li><li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection.">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53 (2006).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination:+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages.">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro.">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li><li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells.">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li><li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR.">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li><li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells.">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li><li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages.">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li><li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate,+Tetrahymena+sp.">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li><li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae:+the+requirement+for+hypoxanthine.">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils.">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li><li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain.">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li></ol>

DNAがヒト細胞にし、内部に取り付け生死菌を特定するための蛍光レクチンと一緒に結合し、実行可能性染料使用する2つのプロトコルがここに提示した。両方のプロトコルが有効に死菌からライブを区別するので、使用するプロトコルの選択は、実験の目的に依存します。第一のプロトコルはそのまま細菌を検出するために、生育不能細菌やSYTO9を検出するために、ヨウ化プロピジウムを使用...

細菌やそれらが存在するホスト間の動的相互作用と共進化があります。細菌が付着小器官、分泌系、および/または宿主食細胞および非貪食細胞のそれらの生産的な感染を可能にする毒素を産生する能力を進化させてきた。細菌は、宿主免疫系の認識と抗菌活性と競合しなければならない。宿主の免疫系は、物理的および化学的障壁、免疫細胞、補体系、及び体液性免疫の他の成分を含む、先天性および適応性の成分から構成されている。多くの細菌は、多層宿主免疫応答による殺傷およびクリアランスを受けやすいが、いくつかの病原性および日和見細菌は、種々の宿主細胞に感染し、宿主免疫応答1によるクリアランスを破壊するメカニズムを進化させてきた。 淋菌は、細菌病原体の一例であるそれは非常に、そのヒト宿主に固執するようになっている。N。淋菌は、容易に尿生殖路、咽頭、結膜、および直腸の粘膜上皮細胞の管の表面にコロニーを形成。植民地化は、粘膜部位に好中球の豊富な採用をトリガします。好中球は、微生物を殺す抗菌様々なプロセスを持っている専門的な食細胞であるが、N。淋菌は、好中球2-5の存在下で生存することが可能である。このようなNとしてどのように細菌性病原体の理解淋菌覆す、抑制し、最終的には、通常敵対ホスト環境で生き残るために免疫応答をハイジャックは、感染症と闘うための新たな治療法の開発に不可欠である。 多くの場合、宿主細胞内での細菌の生存を調査するために使用される実験プロトコルは、コロニーカウントアッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法が挙げられる。コロニー数のアッセイでは、感染した細胞の集団は、WHの洗剤で、例えば（溶解されているICH細菌は細菌を遊離させるために）抵抗性である。溶解物を希釈し、寒天ベースの培地上にプレートし、溶解物中のコロニー形成単位を、各時点および/または実験条件について列挙されている。このアプローチは、全体の細菌集団の生存を報告したが、細胞内と細胞外の生存を区別することはできない。コロニーカウントアッセイの変形、ゲンタマイシン保護アッセイは、具体的には真核生物の原形質膜6を通過する抗生物質ゲンタマイシンできないことに基づいて、細胞内の細菌の生存率を測定する。しかし、このアッセイは、ゲンタマイシン（または同様に、真核生物膜非透過性である別の抗生物質）と内部の細菌へのアクセス権を持っている抗生物質のことができないことによって殺傷に対して感受性である細菌に依存している。したがって、ゲンタマイシン保護アッセイは、すべての細菌種の検査のために有効であるか否よい高度における細菌の生存率を調べると好中球などのピノサイトーシス細胞。 （細菌が凝集体又は異なって、個々の細菌細胞から振る舞う微小コロニーを形成している場合など ）これらのアプローチのいずれも、細胞内局在や個々の細菌の他の動作を明らかにする。個々の外部および内部の細菌の生存率を調べるための別のアプローチは、頻繁に使用される薄切片を透過型電子顕微鏡（TEM）である。それはさらに、亜細胞マーカーに対する金結合抗体を用いて免疫電子顕微鏡によって調査することができる宿主細胞（ 例えばファゴソーム、細胞質、オートファゴソーム）、細菌の位置に関する情報を提供することができるという点で、このアプローチは有利で ​​ある。しかし、電子顕微鏡では、細菌の生存能力を評価することを特に区別されません。埋め込まれた切片は、酢酸ウラニル、クエン酸鉛、または他の電子密度試薬で染色し、電子顕微鏡によって画像化されると、電子密度の高い細菌が生存可能であり、電気考えられているTRONルーセント生育不能7,8。しかし、この仮定はひどく混乱膜や細胞質を欠いたとだけ死菌ので、電子·ルーセントが表示され、細菌の生存能力を過大評価。さらに、いくつかの細菌種は、それが困難な生存率を決定すること、それらの成長段階に応じて、電子密度の範囲を表示することができる。 代替として、またはこれらの広く使用されている方法に加えて、ここでは、宿主細胞によって内在化に取り付けられた細菌の生存を評価するための細菌の生存率を示す蛍光染料の使用のためのプロトコルおよび理論的根拠を提供する。細胞外の細菌を同定するために、感染細胞を、最初のそのようなレクチンまたは細菌特異的抗体などの蛍光試薬にさらされる。感染した細胞は、その後、透過処理し、細菌の生存のための代理として、劣化した膜対そのままで細菌に差動的にアクセス可能なDNA特異的染料にさらされている。最初のP INヨウ化プロピジウムは、膜を侵害しているため、生育不能と考えられているものの細菌のみがアクセスされている間rotocol、膜透過性色素SYTO9は、全細菌集団を同定する。ヨウ化とSYTO9は、バイオフィルム中の細菌の生存能力を評価する非病原性細菌から病原性差別、そして実行可能な水性菌9月12日を列挙するために使用されている。 SYTOXグリーン生育不能人口のみがアクセスされているときに2番目のプロトコルでは、4 &#39;、6&#39;-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）は、総菌数を識別します。これらの生存度色素対は、細菌の細胞内局在を定義する、例えば、目的のタンパク質に関連して各細菌の位置を決定するために、免疫蛍光法と組み合わせることができる。これらのアッセイの使用は、宿主細胞の感染時に細菌殺傷または生存につながる相互作用に重要な洞察を提供します。この資料に記載されているプロトコルは、生存率を評価した好中球ファゴソーム5,13,14の異なる集団に含めた初代ヒト好中球、および内部で接続されている淋菌 。しかしながら、これらのプロトコルは、プロ食細胞、非専門食細胞、および原生動物で15-24グラム陽性およびグラム陰性細菌の生存率を評価するために適用することができる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。これらの疑問を解決するために、現在のプロトコルは、コロニー数アッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、および電子顕微鏡が含まれています。コロニー数およびゲンタマイシン保護アッセイは、全体細菌集団の生存能力を評価し、個々の細菌生存率を測定することができない。電子顕微鏡法は、個々の細菌の生存度を決定し、宿主細胞におけるそれらの局在化に関する情報を提供するために使用することができる。しかし、細菌はしばしば生存率の評価を困難に、電子密度の範囲を示す。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。これらのアッセイは、初代ヒト好中球淋菌の生存を評価するために独自に開発されましたが、あるべき任意の細菌宿主細胞の相互作用にpplicable。これらのプロトコルは、アクセス可能であり、膜不透過性蛍光色素（ヨウ化プロピジウムおよびSYTOXグリーン）のすべての細菌を、染色膜透過性蛍光色素（SYTO9及び4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニル[DAPI]）を、コンバイン生育不能細菌。真核細胞の透過処理の前に、抗体または蛍光試薬は、細胞外細菌を同定するために添加される。したがって、これらのアッセイは、真核細胞への内部付着細菌の生存を判別する。プロトコルは、個々の細菌の細胞内局在を決定するために、真核細胞マーカーに対する蛍光抗体と組み合わせて生存色素を使用するために設けられている。この資料に記載された細菌の生存率染料は、個々の細菌の生存率を評価し、細菌が宿主細胞内で生存する場所に関する情報を提供するために、伝統的な微生物学技術に対して敏感で補体および/または代替物であるS。

概説したプロトコルは、N.の生存を調べた初代ヒト好中球5,26にさらされた後淋菌 。好中球は、感染させたN.淋菌および緑色蛍光生存色素SYTO9及び赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ 図4A）を使用して、プロトコル1で処理した。染料は、優先的に、宿主細胞原形質膜を透過性にするために、コレステロールを隔離サポニンの存在下ではなく、N.添加し?...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

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Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...