Name: fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells at JoVE.com

Vi takker Asya Smirnov og Laura Gonyar for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd NIH R00 TW008042 og R01 AI097312 til AKCMBJ ble støttet delvis av NIH T32 AI007046.

En. Vurdere Bakteriell Levedyktighet med Propidium Jodid og SYTO9 <ol><li> Infisere celler som er tilhenger til 12 mm diameter sirkulære glass dekkglass i 24-brønners plater med bakterier av interesse. IKKE fikser cellene med aldehyder eller organiske løsemidler. </li><li> Vask celler en gang forsiktig i 0,1 M 3 - (N-morfolino) propansulfonsyre (MOPS), pH 7,2, inneholdende 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Inkuber cellene i 10 minutter i mørke ved romtemperatur med Alexa ...

<ol>
	<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77 (2011).</li><li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes.">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li><li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay.">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li><li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).</li><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions.">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+absolute,+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer.">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li><li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization.">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128,+a+fresh-produce+washing+aid,+in+chlorinated+wash+solutions.">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li><li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry:+a+comparison+to+culture-based+techniques.">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).</li><li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils.">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells:+clinical+and+pathogenetic+implications.">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li><li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li><li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection.">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53 (2006).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination:+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages.">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro.">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li><li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells.">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li><li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR.">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li><li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells.">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li><li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages.">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li><li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate,+Tetrahymena+sp.">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li><li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae:+the+requirement+for+hypoxanthine.">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils.">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li><li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain.">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li></ol>

Presenteres her er to protokoller som bruker DNA-binding og levedyktighet fargestoffer i forbindelse med et fluorescerende lectin å identifisere levende og døde bakterier festet til og i humane celler. Siden begge protokollene effektivt diskriminere levende fra døde bakterier, valg av hvilken protokoll som skal brukes avhenger av formålet med forsøket. Den første protokollen bruker propidium iodide å oppdage ikke-levedyktige bakterier og SYTO9 å oppdage intakte bakterier. Vist i figur 4A er et r...

Det er et dynamisk samspill og co-evolusjon mellom bakterier og vertene der de bor. Bakterier har utviklet seg tilslutning organeller, sekresjons-systemer, og / eller evnen til å produsere toksiner som muliggjør deres produktiv infeksjon av verts fagocytisk og ikke-fagocytiske celler. Bakteriene må også kjempe med anerkjennelse og antimikrobielle aktiviteter av vertens immunsystem. Vertsimmunsystemet består av medfødt og adaptiv komponenter, inkludert fysiske og kjemiske barrierer, immunceller, komplementsystemet, og andre komponenter av humoral immunitet. Mens mange bakterier er utsatt for avliving og klaring av det flerlags vertsimmunrespons, har noen patogene og opportunistisk bakterier utviklet mekanismer for å infisere en rekke vertsceller og undergrave klaring av vertsimmunrespons 1.. Neisseria gonorrhoeae er et eksempel på et bakterielt patogen som er sterkt tilpasset til å vedvare i sin menneskelige vert. N. gonorrhoeae lett koloniserer luminal flater av mukosale epitelceller i urogenitaltraktus, svelg, øyets bindehinne, og rektum. Colonization utløser rikelig rekruttering av nøytrofile ved slimhinnesider. Nøytrofiler er profesjonelle fagocytter som besitter en rekke antimikrobielle prosesser for å drepe mikroorganismer, men N. gonorrhoeae er i stand til å overleve i nærvær av neutrofiler 2-5. Forstå hvordan bakterielle patogener som N. gonorrhoeae grave, undertrykke, og kapre immunrespons til slutt overleve i normalt fiendtlige vertsmiljøer er avgjørende for utviklingen av nye behandlingsformer for å bekjempe smittsomme sykdommer. Eksperimentelle protokoller ofte brukes til å undersøke overlevelse av bakterier i vertsceller omfatter kimtall analyser, gentamicin beskyttelse analyser, og elektronmikroskopi. I kimtall analyser, er en befolkning på infiserte celler lysert (for eksempel med et vaskemiddel, r.ich bakteriene er resistente) for å frigjøre bakterier. De lysater blir fortynnet og sådd ut på agar-baserte media, og koloni-dannende enheter i lysatene er oppregnet for hvert tidspunkt og / eller eksperimentelle tilstand. Denne tilnærmingen rapporterer levedyktigheten av hele bakteriepopulasjon, men er ikke i stand til å skille mellom intracellulært og ekstracellulært overlevelse. En variant av den kimtall analyse ble gentamicin beskyttelses assay måler spesielt intracellulær bakteriell overlevelse, på grunnlag av den manglende evnen av de antibiotiske gentamicin å krysse eukaryot plasma membran 6.. Imidlertid er denne analysen er avhengig av bakteriene blir utsatt for å drepe av gentamicin (eller et annet antibiotikum som er tilsvarende eukaryote membran-impermeant) og manglende evne av antibiotika for å få tilgang til indre bakterier. Derfor kan en gentamicin beskyttelse analysen ikke være effektive for undersøkelse av alle bakterielle arter eller når undersøke overlevelse av bakterier høytpinocytic celler som nøytrofile. Ingen av disse tilnærmingene avslører subcellulære lokalisering eller annen oppførsel av enkelte bakterier (f.eks hvis bakterier danner aggregater eller-mikro som oppfører seg annerledes enn enkelte bakterieceller). Et annet ofte brukt metode for å undersøke gjennomførbarheten av de enkelte eksterne og interne bakterier er tynn-snitt transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Denne fremgangsmåten er fordelaktig ved at det kan gi informasjon angående beliggenheten av bakteriene i vertsceller (f.eks phagosome, cytoplasma, autophagosome), som kan bli ytterligere undersøkt ved mikroskopi immunoelectron med gull-koplet antistoffer mot subcellulære markører. Imidlertid er elektronmikroskopi ikke spesielt følsom ved å vurdere bakteriell levedyktighet. Når innebygde seksjoner er farget med uranyl-acetat, bly-citrat eller andre elektron-tette reagenser og avbildes ved elektronmikroskopi, er elektron-tette bakterier betraktes levedyktig og elektron-Lucent nonviable 7,8. Men overvurderer denne antakelsen bakteriell levedyktighet, siden bare de døde bakterier med alvorlig forstyrret membraner og blottet for cytoplasma vises elektron-Lucent. I tillegg kan enkelte bakteriearter viser et utvalg av elektrontetthet avhengig av deres vekstfase, som gjør det vanskelig å bestemme levedyktigheten. Som et alternativ eller i tillegg til disse brukte metoder, her vi gi protokoller og begrunnelse for bruk av fluorescerende fargestoffer som indikerer bakteriell levedyktighet for å vurdere overlevelse av bakteriene som er koblet til og internalis av vertsceller. For å identifisere ekstracellulære bakterier, blir infiserte celler først eksponert for en fluorescerende reagens, for eksempel en lektin-eller bakterie-spesifikke antistoff. De infiserte cellene blir deretter permeabilized og utsatt for DNA-spesifikke fargestoffer som er differensielt tilgjengelig for bakterier med intakt g. degradert membraner, som et surrogat for bakteriell levedyktighet. I den første protocol, identifiserer membranen gjennomtrengelig fargestoff SYTO9 den totale bakteriepopulasjon, mens propidium iodide er kun tilgjengelig for de bakteriene som har kompromittert membraner og er dermed å betrakte nonviable. Propidium iodide og SYTO9 har blitt brukt til å evaluere bakteriell levedyktighet i biofilm, diskriminere patogene fra nonpathogenic bakterier, og nummerere levedyktige vannbårne bakterier 9-12. I den andre protokollen, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifiserer totale bakterier, mens SYTOX Green er kun tilgjengelig for den ikke-levedyktig populasjon. Disse levedyktighet fargestoff parene kan kombineres med immunfluorescens å bestemme hver bakterie plassering i forhold til et protein av interesse, for eksempel for å definere bakteriell subcellulær lokalisering. Bruken av disse analysene gir viktig innsikt inn i de vekselvirkninger som gir bakterie-drepende eller overlevelse under infeksjon av vertsceller. Protokollene er skissert i denne artikkelen ble brukt til å vurdere levedyktighetenN. gonorrhoeae som er knyttet til og i primære humane nøytrofile, herunder i ulike populasjoner av nøytrofile phagosomes 5,13,14. Imidlertid kan disse protokoller anvendes for å vurdere levedyktigheten til gram-positive og gram-negative bakterier i profesjonelle fagocytter, ikke-profesjonelle fagocytter, og protozoer 15-24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Sentralt til feltet av bakteriell patogenesen er evnen til å definere om og hvordan mikrober overlever etter eksponering for eukaryote celler. Nåværende protokoller for å håndtere disse spørsmålene omfatter kimtall analyser, gentamicin beskyttelse analyser, og elektronmikroskopi. Kimtall og gentamicin beskyttelse analyser bare vurdere levedyktigheten av hele bakteriepopulasjon og er ute av stand til å avgjøre enkelt bakteriell levedyktighet. Elektronmikroskopi kan brukes til å bestemme levedyktigheten til de enkelte bakterier og gi informasjon med hensyn til deres lokalisering i vertsceller. Imidlertid bakterier ofte et utvalg av elektron-tettheter, slik at evaluering av levedyktighet vanskelig. Denne artikkelen beskriver protokoller for ved bruk av fluorescerende fargestoffer som viser levedyktigheten til de enkelte bakterier i og er forbundet med vertsceller. Disse analysene ble opprinnelig utviklet for å vurdere overlevelse av Neisseria gonorrhoeae i primære humane nøytrofiler, men bør være enpplicable til enhver bakterie-verten celle interaksjon. Disse protokollene kombinere membran-gjennomtrengelige fluorescerende fargestoffer (SYTO9 og 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), som flekker alle bakterier, og membran-ugjennomtrengelig fluorescerende fargestoffer (propidium jodid og SYTOX grønt), som bare er tilgjengelig for ikke-levedyktige bakterier. Før eukaryot celle permeabilization, er et antistoff eller fluorescerende reagens tilsettes for å identifisere ekstracellulære bakterier. Dermed disse assays diskriminere levedyktigheten til bakteriene vedheftende til og i eukaryote celler. En protokoll er også tilveiebrakt for bruk av levedyktighet fargestoffer i kombinasjon med fluoriserende antistoffer mot eukaryotiske celle markører, for å bestemme den subcellulære lokalisering av de enkelte bakterier. Den bakterielle levedyktighet fargestoffer omtalt i denne artikkelen er en følsom supplement og / eller alternativ til tradisjonelle mikrobiologi teknikker for å evaluere levedyktighet av individuelle bakterier og gi informasjon om hvor bakterier overleve i vertscelles.

De protokoller som er beskrevet ble brukt til å undersøke overlevelse av N. gonorrhoeae etter eksponering for primær menneskelig nøytrofile 5,26. Nøytrofile ble infisert med N. gonorrhoeae og behandles med protokollen 1, ved hjelp av den grønne fluorescerende fargestoff SYTO9 levedyktighet og den rød-fluorescerende propidium jodid (figur 4A). De fargestoffer som ble tilsatt i nærvær av saponin, som sequesters kolesterol til preferensielt permeabilize vertscelleplasm...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells at JoVE.com

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Sentralt til feltet av bakteriell patogenesen er evnen til å definere om og hvordan mikrober overlever etter eksponering for eukaryote celler. Denne artikkelen beskriver protokoller for ved bruk av fluorescerende fargestoffer som viser levedyktigheten til de enkelte bakterier i og er forbundet med vertsceller.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Medgjørlig pattedyrcelle Infeksjoner med protozoan-primet Bakterier

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Bruk av bildecytometri for kvantifisering av patogene sopper i foreningen med Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiser (FISH) for lokalisering av virus og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insekt Vev

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation av Funksjonelle Bakterielle Effektor i pattedyrceller

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som modellorganisme for Assessing Interaksjon av anaerobe bakterier med vertsceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...