Name: a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2013-11-09T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Zwitserse National Science Foundation en door de Staat van Genève.

Zodra de MKBA wordt gemonteerd, wordt de groei van embryo gevolgd gedurende meerdere dagen. Daarom, voordat het zaad dissectie procedure en montage van de MKBA, moet men zaden steriliseren om toekomstige besmettingen dat een goede beoordeling van het effect van de zaadhuid materiaal op embryonale groei zou kunnen voorkomen te vermijden. 1. Zaadsterilisatie <ol><li> Giet 50-60 pl volwassen en droge Arabidopsis zaden in een 1,5 ml microcentrifugebuis en stelt een 70% ethanoloplossin...

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

De zaadhuid beddengoed assay (SCBA) hier beschreven procedure is in principe van toepassing op alle gevallen waarin Arabidopsis zaadontkieming is geblokkeerd (of vertraagd) en waar het endosperm wordt vermoed dat deze arrestatie te implementeren. Dit laatste kan worden aangetoond door het verwijderen van de zaadhuid (testa en endosperm) en constateren dat de embryonale groei verloopt sneller ten opzichte van die waargenomen bij embryo&#39;s worden omgeven door de zaadhuid. Kieming kan worden geblokkeerd in antw...

In Arabidopsis rijpe zaden, is de zaadhuid samengesteld uit de testa, een deklaag van dood weefsel afkomstig van de moeder, en het endosperm, een enkele cel laag van levend weefsel direct rondom het embryo 1. Het endosperm en het embryo zijn afgeleid van afzonderlijke bevruchting gebeurtenissen: het endosperm is een triploïde weefsel met twee moeders en een vaderlijke genoom, terwijl het embryo is een diploïde weefsel met een moeder en een vaderlijke genoom 2. De belangrijkste functie van oudsher toegewezen aan het endosperm dat een voedings weefsel. Het wordt echter steeds duidelijker dat de endosperm speelt een centrale rol zaadkieming controleren. Deze gedachte werd eerst zichtbaar bij slaaptoestand, een eigenschap vertoond door nieuw geproduceerde zaden. Slapende zaden niet ontkiemen ondanks de aanwezigheid van gunstige kieming omstandigheden. Zaden verliezen hun rustperiode na een rijpingsperiode en word nondormant, dat wil zeggen zij zullen ontkiemen bij blootstelling aan gunstige kieming omstandigheden. In veel plantensoorten, waaronder de modelplant Arabidopsis, wordt de zaadhuid absoluut noodzakelijk om de kieming van slapende zaden voorkomen sinds zaadhuid verwijderen triggers embryonale groei en vergroening van 3,4. In Arabidopsis, Bethke et al.. Opgemerkt dat kieming bleef verdrongen na het verwijderen van de zaadhuid met behoud van het endosperm rondom het endosperm 5. Deze waarnemingen sterk aangegeven dat het endosperm is het weefsel in de zaadhuid uitoefenen van een repressieve activiteit op het embryo. Echter, zaadhuid verwijderd experimenten niet noodzakelijkerwijs te hebben de aard van de kieming repressieve activiteit door de zaadhuid of identificeren van de genen die implementeren. We onlangs een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) waar zaadvliezen en embryo fysiek gescheiden, maar in nauwe Proxi gehoudenMITY zodat de kiemkracht repressieve activiteit door het endosperm gehandhaafd 6. De MKBA maakt het combinatorische gebruik van slapende, nondormant, en genetisch gemodificeerde zaadhuid en embryonale materialen. Hierdoor kan de genetische leidend naar kieming en specifiek actief zijn in het endosperm en embryo worden ontleed. De MKBA werd gebruikt in het kader slaaptoestand te tonen dat het endosperm releases het plantenhormoon abscisinezuur (ABA) naar het embryo om haar groei 6 onderdrukken. Verder konden we de MKBA gebruiken om de signaalwegen die in endosperm en embryonale weefsels te identificeren kiemrust te promoten. De rol van het endosperm ontkieming controle werd verder versterkt door te kijken bij nondormant zaden blootgesteld aan een puls van ver rood (FR) licht. Vroeg op zaad imbibitie een FR lichtpuls is bekend dat kieming 7,8 remmen. Toen zaadvliezen werden verwijderd uit zaden een puls van FR lichtkon kieming remmen sterk suggereert dat het endosperm ook onderdrukken de kieming van zaden nondormant 9. Opmerkelijk kan de MKBA worden gebruikt FR-afhankelijke remming van kieming recapituleren. Hierdoor konden aantonen dat FR-afhankelijke remming van zaadkieming ook werkwijzen waarbij ABA afgifte uit het endosperm 9. Bovendien is de MKBA toegestaan ​​identificeren van de verschillende licht-signaalwegen die actief zijn in het endosperm en het embryo te nondormant zaadontkieming besturen in reactie op licht signalen 9,10. De MKBA lijkt dus een betrouwbare techniek om de functie van het endosperm onderzoeken in het kader van de controle van zaadkieming zijn. Het is ook een krachtig instrument om te beoordelen in vitro of genen verdacht kieming bedienen in het endosperm, het embryo of beide weefsels. Hier hebben we detail de verschillende stappen die nodig zijn om een ​​MKBA monteren.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

De Arabidopsis endosperm bestaat uit een enkele cellaag rondom de rijpe embryo en speelt een essentiële rol bij de kieming van slapende zaden of van nondormant zaden bestraald door een veel rood (FR) lichtpuls voorkomen. Om inzicht te krijgen in de moleculaire genetische mechanismen ten grondslag liggen aan de kieming repressieve activiteit wordt uitgeoefend door de endosperm verder te krijgen, een &quot;zaadhuid bedding&quot; assay (SCBA) werd bedacht. De MKBA is een dissectie procedure fysiek te scheiden zaadvliezen en embryo&#39;s van zaden, die zorgt voor de opvolging van de groei van embryo&#39;s op een onderliggende laag van zaadvliezen. Opmerkelijk de MKBA reconstrueert de kieming repressieve activiteiten van de zaadhuid in het kader van kiemrust en FR-regeling van zaadkieming. Aangezien de MKBA maakt het combinatorische gebruik van slapende, nondormant en genetisch gemodificeerde zaadhuid en embryonale materialen, de genetische wegen controlerende kieming en specifiek operating in het endosperm en embryo kan worden ontleed. Hier hebben we detail de procedure om een ​​MKBA monteren.

Eerder werk toonde dat mutante zaden niet synthetiseren GA konden ontkiemen als gevolg van de hoge ABA accumulatie in zaden 11,12. Echter, het onvermogen om te ontkiemen vereist de zaadhuid sinds de verwijdering triggers embryonale groei 13. Deze zeer wenselijk dat de endosperm van zaden niet te synthetiseren GA is het vrijgeven van ABA embryonale groei blokkeren. We verwachten dan zaden lagen niet synthetiseren GA de groei van embryo&#39;s in een MKBA tegenstelling zaadhuiden niet synthetiseren GA...

Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em&gt; In Vitro</em&gt; Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

Het gebruik van Arabidopsis mutanten eceriferum naar Plant Nagelriem Biosynthese Explore

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

Een eenvoudige droge sectiemethode voor het verkrijgen van hele zaad-sized hars sectie en de toepassingen ervan

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

Analyse van het effect van samengestelde zoutstress op zaadkieming en zouttolerantie analyse van peper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells (Video) | JoVE 

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering van zinktransporters bij zoogdieren met behulp van een in-vitro-zinktransporttest

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

An Improved Method to Measure Pollen Hydration Profiles in Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition and its Measurements

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition and its Measurements (Video) | JoVE 

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition en de metingen ervan