Name: a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2013-11-09T21:00:00
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Este trabalho foi financiado por concessões do National Science Foundation suíço e pelo Estado de Genebra.

Uma vez que o ARA está montado, o crescimento dos embriões é monitorizado ao longo de vários dias. Portanto, antes do procedimento de dissecção sementes e montagem do equipamento autônomo, é preciso esterilizar as sementes, para evitar contaminações futuras que poderiam impedir a adequada avaliação do efeito do material de revestimento da semente no crescimento embrionário. 1. Esterilização Semente <ol><li> Despeje 50-60 ul de sementes de Arabidopsis maduros e secos...

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

Procedimento O ensaio da cama tegumento (SCBA) aqui descrito é, em princípio, aplicável a qualquer circunstância em que a germinação de sementes de Arabidopsis é bloqueado (ou atrasado) e onde o endosperma é suspeito de implementar esta prisão. Este último pode ser evidenciada através da remoção do revestimento de semente (testa e do endosperma) e observando-se que os rendimentos de crescimento mais rápidas embrionárias relativos à observada quando os embriões são rodeados pelo revestimento da...

Na Arabidopsis, as sementes maduras, o revestimento de semente é composto do testa, a camada externa do tecido morto de origem materna, e o endosperma, uma camada única de células de tecido vivo, que rodeia o embrião 1. O endosperma e o embrião são derivadas de eventos de fertilização separadas: o endosperma é um tecido com duas triplóides materno e um genoma paterno enquanto que o embrião é um tecido com um diplóide materno e um genoma paterno 2. A principal função tradicionalmente designado para o endosperma é a de um tecido nutritivo. No entanto, torna-se cada vez mais evidente que o endosperma também desempenha um papel central para controlar a germinação das sementes. Esta noção tornou-se aparente pela primeira no caso de dormência, uma característica exibida por sementes produzidos recentemente. Sementes dormentes não germinam apesar da presença de condições de germinação favoráveis. Sementes perdem sua dormência depois de um período de maturação e se tornar nondormant, ou seja, elas vão germinar quando expostos a condições favoráveis ​​de germinação. Em muitas espécies de plantas, incluindo a planta modelo Arabidopsis, o tegumento é absolutamente necessário para impedir a germinação de sementes dormentes desde remoção do tegumento desencadeia o crescimento embrionário e greening 3,4. Na Arabidopsis, Bethke et al. Observou-se que a germinação permaneceu reprimida após a remoção do tegumento, mantendo o endosperma envolvente do endosperma 5. Estas observações indicaram nitidamente que o endosperma é o tecido no interior do revestimento de semente de exercer uma actividade repressiva sobre o embrião. No entanto, as experiências de remoção do tegumento não necessariamente ajudar a esclarecer a natureza da atividade repressiva germinação fornecido pelo tegumento nem identificar os genes que a implementam. Recentemente, lançou um ensaio semente cama casaco (ARA), onde casacos de sementes e embriões são separados fisicamente, mas manteve em estreita proxidade, de modo que a actividade repressora germinação fornecida pelo endosperma é mantido 6. O SCBA permite o uso combinatória de tegumento dormente, nondormant e geneticamente modificada e materiais embrionárias. Como resultado, as vias genéticas que controlam a germinação e operando especificamente no endosperma e no embrião pode ser dissecado. O ARA foi utilizado no contexto de dormência para mostrar que o endosperma liberta o ácido abscísico fitohormona (ABA) em direcção ao embrião para reprimir o crescimento 6. Além disso, podemos usar a ARA para identificar as vias de sinalização que operam no endosperma e nos tecidos embrionários para promover a dormência. O papel do endosperma para controlar a germinação foi reforçada por considerar o caso das sementes nondormant expostas a um pulso de longe vermelho (FR) de luz. Cedo após a embebição das sementes um pulso de luz FR é conhecido por inibir a germinação 7,8. Quando tegumento foram removidos a partir de sementes de um pulso de luz FRfoi incapaz de inibir a germinação, sugerindo fortemente que o endosperma também pode reprimir a germinação das sementes nondormant 9. Notavelmente, o ARA também poderia ser usado para recapitular dependente da FR inibição da germinação. Isto permitiu demonstrar que a inibição dependente da FR de germinação das sementes é também um processo que envolve a libertação a partir do endosperma do ABA 9. Além disso, o ARA permitiu identificar as diferentes vias de sinalização luminosa que operam no endosperma e no embrião para controlar a germinação das sementes nondormant em resposta a sinais de luz 9,10. O ARA, por conseguinte, parece ser uma técnica de confiança para explorar a função do endosperma no âmbito do controlo de germinação de sementes. É também uma ferramenta poderosa para avaliar in vitro se os genes suspeitos de controlar a germinação operar no endosperma, o embrião ou de ambos os tecidos. Aqui detalhamos os vários passos necessários para montar um autônomo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

O endosperma de Arabidopsis consiste de uma única camada celular em torno do embrião maduro e desempenha um papel essencial para prevenir a germinação de sementes dormentes ou que de sementes nondormant irradiados por um pulso de luz vermelho longínquo (FR). A fim de obter mais conhecimentos sobre os mecanismos genéticos moleculares subjacentes à atividade repressiva germinação exercida pelo endosperma, um ensaio de &quot;semente da cama casaco&quot; (ARA) foi inventado. O SCBA é um procedimento de dissecção separando fisicamente casacos de sementes e embriões de sementes, o que permite monitorar o crescimento de embriões em uma camada subjacente de tegumento. Notavelmente, o SCBA reconstitui a germinação atividades repressivas do tegumento da semente no contexto da dormência de sementes e controle de FR-dependente de germinação das sementes. Uma vez que o equipamento autônomo permite o uso combinatória de tegumento dormente, normais e sob geneticamente modificado e materiais embrionárias, os caminhos genéticos que controlam a germinação e, especificamente, operating no endosperma e embrião pode ser dissecado. Aqui detalhamos o procedimento para montar um autônomo.

Trabalhos anteriores mostraram que as sementes mutantes incapazes de sintetizar GA foram incapazes de germinar, como resultado da acumulação de alta ABA nas sementes 11,12. No entanto, a incapacidade de germinar requer a casca da semente, desde a sua remoção provoca embrionário 13 crescimento. Isto indica fortemente que o endosperma de sementes incapazes de sintetizar o GA está lançando ABA para bloquear o crescimento embrionário. Esperamos, portanto, o tegumento das sementes incapazes de s...

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A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

A Brasão Cama Ensaio de Sementes para explorar Geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Como a germinação Controles do endosperma das sementes em<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Nós apresentamos o procedimento para montar um ensaio da cama tegumento (SCBA) de Arabidopsis thaliana sementes. O ARA foi demonstrado ser uma ferramenta poderosa para explorar geneticamente e in vitro como a germinação de sementes de controlo do endosperma de sementes de dormentes e em resposta a sinais de luz. O SCBA é, em princípio, aplicável em qualquer situação em que se suspeita que o endosperma para influenciar o crescimento embrionário.

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

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