Name: identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Ringraziamo Angelika Berg per l&#39;assistenza di laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto e finanziato dalla Max Planck Society e la Scuola di Jena per microbica Communication (JSMC).

1. Insetto allevamento <ol><li> Acquistare o avere uova grinfie di Spodoptera littoralis dal proprio allevamento. Mantenerle in piastre sterili a temperatura ambiente (RT) fino alla schiusa. </li><li> Preparare la dieta artificiale per gli insetti che allevano come segue: <ol><li> Mettere a bagno i fagioli bianchi 500 g di terra durante la notte in 100 ml di acqua. </li><li> Aggiungere 9,0 g di acido ascorbico e 75 g di agar a 1000 ml di acqua distillata H 2 O e poi bollire. </li><li> Lasciare la m...

<ol>
	<li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction,+digestion,+and+immunity+processes+of+its+host,+the+tsetse+fly.">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li><li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore.">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note:+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone.">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses:+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera.">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li><li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota.">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li><li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endosymbionts+of+insects:+insights+from+comparative+genomics.">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li><li>Brune, A., VH, R. e. s. h., Card&#233;, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).</li><li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites.">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li><li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods.">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li><li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae.">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li><li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae.">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation.">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li><li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach.">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li><li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP.">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li><li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere.">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li><li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology.">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li><li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits:+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil.">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

L&#39;intestino della maggior parte degli insetti ospita una comunità microbica ricco e complesso, in genere 10 7 -10 9 cellule procariote alloggiano lì, superando in numero le cellule dell&#39;ospite nella maggior parte dei casi. Così, l&#39;intestino insetto è un &quot;hot spot&quot; per diverse attività microbiche, che rappresenta molteplici aspetti delle relazioni microbici, da patogenesi di obbligare mutualismo 27. Anche se molti studi hanno descritto una straordinaria varietà...

Associazioni simbiotiche Insect-batteriche sono conosciute per un gran numero di specie di insetti 7. In queste associazioni simbiotiche, i microrganismi svolgono un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo di insetti. I microbi hanno dimostrato di contribuire alla riproduzione insetto 1, feromone biosintesi 3, alimentazione, compresa la sintesi di amminoacidi essenziali 4, e la digestione del cibo inaccessibili all&#39;host. Nonostante la grande varietà di associazioni gut-batterica, tanto meno si sa circa il ruolo funzionale che svolgono a favore degli insetti. Solo in caso di termiti, la digestione simbiotico di lignocellulosa effettuata da procarioti, protozoi e funghi, è stata ampiamente studiata 8,9. In contrasto con questo, poco si sa circa l&#39;associazione simbiotica presente nell&#39;intestino degli insetti generalisti cioè il leafworm cotone, Spodoptera littoralis. Inoltre, a causa del loro spostamento frequente di piante ospiti, generaleTSI insetti e loro intestino comunità batteriche associate sono esposti in modo permanente alle nuove sfide legate alle loro abitudini alimentari consumando piante con una pletora di sostanze fitochimiche. Oltre a questo, l&#39;ambiente intestinale in lepidotteri, costituisce di per sé un ambiente difficile per la crescita di batteri causa della elevata budello pH 10. In particolare nel caso di S. littoralis, si va dal 10,5 al foregut, ca. 9 nella midgut a pH quasi 7 nella hindgut 11. D&#39;altra parte, la comunità batterica associata con l&#39;intestino di S. littoralis è semplice. Tang, Freitak, et al. 12 hanno riportato un massimo di 36 filotipi appartenenti ad un totale di 7 diverse specie batteriche come unici membri della comunità batterica associata a questo insetto. Oltre a questo, non complicata procedura allevamento è necessaria per la crescita degli insetti in laboratorio. Inoltre, questo e il breve ciclo di vita dell&#39;insetto facilitare multi-gstudi enerational, trasformando questa specie in un sistema modello ideale per lo studio delle interazioni gut-microbo. Con l&#39;avvento delle tecnologie di sequenziamento basate sulla PCR, il numero di studi che si occupano di budello biota di diversi organismi (cioè esseri umani, insetti o organismi marini) è aumentata. Inoltre, i risultati sono indipendenti da isolamento e la coltura dei batteri intestinali nutrito come in passato. Quasi il 99% dei batteri non sono coltivabili e la simulazione delle condizioni ambientali prevalenti nell&#39;intestino è difficile 12. Utilizzando PCR, 16S rRNA frammenti di geni (un gene marcatore filogenetico ampiamente utilizzato tra i batteri) potrebbero essere selettivamente amplificati da un modello di DNA misto di comunità batteriche intestinali, sequenziati e clonati. Con queste informazioni, l&#39;utente è in grado di identificare le specie batteriche dopo aver recuperato le informazioni sulla sequenza da database pubblici 13,14. Tuttavia, la sequenza si avvicina a descrivere battericacomunità rimangono insufficienti a causa della mancanza di informazioni sul contributo metabolica intrinseca delle singole specie all&#39;interno della comunità. Stabile-isotopo sondaggio (SIP) è una tecnica priva di cultura promettente. E &#39;spesso utilizzato in microbiologia ambientale per analizzare filogenesi microbica legati a particolari attività metaboliche. Ciò si ottiene usando stable, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, quali acidi grassi derivati ​​da fosfolipidi, DNA e RNA 5. Quando si considera acidi nucleici, la metodologia è basata sulla separazione di 13 C-marcato DNA o RNA dal DNA non marcato dal gradiente di densità ultracentrifugazione 6. A causa di questa connessione diretta tra l&#39;etichetta DNA e l&#39;attività metabolica, un&#39;analisi molecolare a valle degli acidi nucleici individua le specie e fornisce informazioni sulle attività metaboliche. Inoltre, la combinazione di DNA-SIP e pyrosequencing come applicato dallaPilloni, von Netzer, et al. 15, permette una particolare identificazione semplice e sensibile delle specie batteriche presenti nella frazione DNA pesante 13 C-marcato. Fino ad ora, questa tecnica è stata applicata per descrivere le comunità batteriche coinvolte in processi biochimici nel terreno sotto 16,17 aerobiche e anaerobiche condizioni 18,19. Oltre all&#39;uso in scienze ambientali, la tecnica è stata applicata per la medicina come riportato da Reichardt, et al. 5, che descrive le attività metaboliche dei diversi gruppi filogenetici del microbiota intestinale umano in risposta ad un carboidrato nondigestible. Qui usiamo 13 C-glucosio di &#39;label&#39; il DNA delle specie batteriche metabolicamente attivi nell&#39;intestino. Il glucosio è uno zucchero utilizzato dalla maggior parte delle specie batteriche lungo la diffusa Entner-Doudoroff (ED) percorso, anche se le eccezioni sono noti 20. Questogiustifica l&#39;utilizzo di 13 C-glucosio come sonda metabolico affidabile che fornisce un collegamento tra metaboliti di interesse e la fonte di carbonio lungo percorsi stabiliti. A seconda della domanda scientifica, altri substrati, cioè 13 C-metano, 13 CO 2, o piante ottenute sotto atmosfera di 13 CO 2, può essere utilizzato per affrontare attività metaboliche. A questo punto, presentiamo il protocollo applicato nella caratterizzazione metabolica della comunità batterica intestinale di un insetto generalista, cioè S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Inoltre, la tecnica è stata accoppiata con pyrosequencing, che a sua volta permette l&#39;identificazione di insetto comunità batterica intestinale con alta risoluzione e precisione. Come substrato principale, 13 C-glucosio marcato è stato utilizzato durante gli esperimenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

Guts della maggior parte degli insetti sono abitate da comunità complesse di batteri non patogeni simbiotici. All&#39;interno di queste comunità microbiche è possibile identificare commensali o batteri mutualistiche specie. Questi ultimi, sono stati osservati per servire molteplici funzioni per l&#39;insetto, ossia ad assistere nella riproduzione insetto 1, stimolare la risposta immunitaria 2, produzione feromone 3, così come la nutrizione, tra cui la sintesi di amminoacidi essenziali 4, tra gli altri. Data l&#39;importanza di queste associazioni, sono stati fatti molti sforzi per caratterizzare le comunità fino ai singoli membri. Tuttavia, la maggior parte di questi sforzi sono stati entrambi basati su metodi di coltivazione o invocato la generazione di frammenti del gene 16S rRNA che sono stati sequenziati per l&#39;identificazione finale. Purtroppo, questi approcci solo individuate le specie batteriche presenti nell&#39;intestino e non hanno fornito alcuna informatione sull&#39;attività metabolica dei microrganismi. Per caratterizzare le specie batteriche metabolicamente attive nell&#39;intestino di un insetto, abbiamo usato isotopo stabile tastatura (SIP) in vivo impiegando 13 C-glucosio come substrato universale. Questa è una tecnica priva di cultura promettente che permette il collegamento di filogenesi microbica per la loro particolare attività metabolica. Ciò è possibile inseguimento stabili, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, come DNA e RNA 5. L&#39;incorporazione di 13 C isotopi nel DNA aumenta la densità del DNA marcato rispetto al non marcato (12 C) uno. Alla fine, il DNA 13 C-marcato o RNA è separato mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità del 12 C-marcato una simile 6. La successiva analisi molecolare dei isotopomeri separati acidi nucleici fornisce il collegamento tra l&#39;attività metabolica e l&#39;identità delle specie. Qui vi presentiamo il protocollo utilizzato per caratterizzare i batteri metabolicamente attivi nell&#39;intestino di un insetto generalista (il nostro modello di sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L&#39;analisi filogenetica del DNA è stata effettuata usando pyrosequencing, che ha permesso alta risoluzione e precisione nell&#39;identificazione del budello insetto comunità batterica. Come substrato principale, 13 C-glucosio marcato è stato usato negli esperimenti. Il substrato è stato alimentato agli insetti con una dieta artificiale.

Per ottenere un&#39;etichettatura adeguata dei batteri metabolicamente attive presenti nell&#39;intestino dell&#39;insetto, l&#39;insetto deve essere esposto alla ricca-C substrato 13 per un periodo già ottimizzata sufficiente per consentire la separazione della frazione più pesante etichettata facilmente dal marcato leggero. Nel nostro caso, 13 C-glucosio è stata integrata nella dieta artificiale ad una concentrazione finale di 10 mM per 1 giorno (Figura 1A). La stessa quantit?...

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Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

La comunità batterica attivo associato con l&#39;intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l&#39;identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all&#39;interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

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DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Stabilire culture binarie stabili di Saccharibacteria simbiotici dalla cavità orale

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...