Name: identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Vi takker Angelika Berg for laboratorie assistanse. Dette arbeidet ble støttet og finansiert av Max Planck Society og Jena School for Microbial Communication (JSMC).

En. Insect stell <ol><li> Kjøpe eller få egg klørne til Spodoptera littoralis fra ditt eget oppdrett. Holde dem i sterile petriskåler ved romtemperatur (RT) før klekking. </li><li> Forbered kunstig diett for insekter oppdrett som følger: <ol><li> Sug 500 g malte hvite bønner over natten i 100 ml vann. </li><li> Til 9,0 g askorbinsyre og 75 g agar i 1000 ml destillert H2O, og deretter koke den. </li><li> La blandingen avkjøles, og når det størkner (til et hvitt voksaktig faststoff-blanding...

<ol>
	<li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction,+digestion,+and+immunity+processes+of+its+host,+the+tsetse+fly.">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li><li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore.">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note:+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone.">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses:+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera.">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li><li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota.">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li><li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endosymbionts+of+insects:+insights+from+comparative+genomics.">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li><li>Brune, A., VH, R. e. s. h., Card&#233;, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).</li><li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites.">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li><li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods.">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li><li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae.">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li><li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae.">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation.">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li><li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach.">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li><li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP.">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li><li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere.">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li><li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology.">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li><li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits:+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil.">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

Tarmen av de fleste insekter havner en rik og kompleks mikrobielle samfunn, vanligvis 10 7 -10 9 prokaryote celler losjere det, outnumbering vertens egne celler i de fleste tilfeller. Dermed er insekt gut en &quot;hot spot&quot; for ulike mikrobielle aktiviteter, som representerer flere aspekter av mikrobielle forhold, fra patogenesen å forplikte mutualism 27. Selv om mange studier har beskrevet en utrolig variasjon av insekt gut mikrobielle samfunn, karakterisering av metabolsk aktivit...

Insekt-bakterielle symbiotiske foreninger er kjent for et stort antall insektarter 7. I disse symbiotiske foreninger, mikroorganismer spiller viktige roller i vekst og utvikling av insekter. Mikrober har vist seg å bidra til en insekt reproduksjon 1, feromon biosyntese 3, ernæring, inkludert syntese av essensielle aminosyrer til 4, og fordøyelsen av mat utilgjengelige til verten. Til tross for den enorme utvalg av gut-bakteriell foreninger, er mye mindre kjent om den funksjonelle rollen de spiller i favør av insekt. Bare i tilfelle av termitter, det symbiotiske fordøyelsen av lignocellulose utført av prokaryoter, protozoer og sopp, har vært mye studert 8,9. I kontrast til dette, er lite kjent om det symbiotiske foreningen til stede i tarmen av genera insekter dvs. bomull leafworm, littoralis Spodoptera. Videre, på grunn av deres hyppige skift av plante verter, generalist insekter og deres gut forbundet bakteriesamfunn er permanent utsatt for nye utfordringer knyttet til deres matvanene forbruker planter med en mengde fytokjemikalier. Foruten dette, tarmmiljøet i sommerfugler, utgjør i seg selv et barskt miljø for vekst av bakterier på grunn av den høye pH 10 tarmen. Spesielt i tilfelle av S. littoralis, varierer det fra 10,5 i forutgående, ca. 9 i midgut til pH nesten 7 i hindgut 11. På den annen side, den bakterielle fellesskap forbundet med tarmen S. littoralis er enkel. Tang, Freitak, et al. 12. rapportert maksimalt 36 phylotypes hører til totalt 7 forskjellige bakteriearter som bare medlemmer av bakterie fellesskap forbundet med dette insekt. I tillegg til dette, er ikke noe komplisert oppdrett prosedyre kreves for insektvekst i laboratoriet. Videre er dette og den korte levetid av insekt lette multi-generational studier, snu denne arten til en ideell modell for å studere gut-mikrobe interaksjoner. Med bruk av PCR-basert sekvensering teknologier, har antall studier som omhandler gut biota av flere organismer (dvs. mennesker, insekter, eller marine organismer) økt. Videre resultatene er uavhengige fra isolasjon og dyrking av tarm næret bakterier som i det siste. Nesten 99% av bakterier er ikke dyrkbar og simulering av miljøforholdene som råder i tarmen er vanskelig tolv. Ved hjelp av PCR, kunne 16S rRNA genet fragmenter (et mye brukt fylogenetisk gente blant bakterier) selektivt forsterket fra en blandet DNA mal av gut bakteriesamfunn, sekvensert, og klonet. Med denne informasjonen, er brukeren i stand til å identifisere de bakteriearter etter henting sekvensen informasjon fra offentlige databaser 13,14. Likevel nærmer seg sekvensering for å beskrive bakteriellsamfunnene fortsatt utilstrekkelig på grunn av manglende informasjon om den iboende metabolske bidrag av de enkelte arter i samfunnet. Stabil-isotop sondering (SIP) er en lovende kultur-fri teknikk. Det er ofte brukt i miljømikrobiologi å analysere mikrobielle phylogenies knyttet til bestemte metabolske aktiviteter. Dette oppnås ved å spore stabile isotop-merket atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører som fosfolipid-avledede fettsyrer, DNA og RNA 5. Ved vurdering av nukleinsyrer, er metoden basert på separasjon av 13C-merket DNA eller RNA fra umerket DNA med densitet gradient-ultrasentrifugering 6.. På grunn av den direkte forbindelse mellom DNA-etikett og metabolske aktivitet, en nedstrøms molekylær analyse av nukleinsyrene identifiserer arten og gir informasjon om metabolske aktiviteter. Videre kombinasjon av DNA-SIP og pyrosequencing som anvendes avPilloni, von Netzer, et al. 15, tillater en særlig enkel og sensitiv identifisering av bakterielle arter tilstede i den tunge 13 C-merket DNA-fraksjon. Inntil nå, har denne teknikken er brukt for å beskrive de bakteriesamfunn involvert i biogeokjemiske prosesser i jord under aerobe 16,17 og anaerobe forhold 18,19. I tillegg til bruk i miljø, har teknikken blitt anvendt i medisinsk vitenskap som rapportert av Reichardt, et al. Fem, som beskrev de metabolske aktiviteter av forskjellige fylogenetiske grupper av den menneskelige tarmfloraen som reaksjon på et ikke-fordøyelig karbohydrat. Her benyttes 13C-glukose til å &quot;label&quot; DNA av metabolsk aktive bakteriearter i tarmen. Glukose er en sukker benyttes av de fleste bakterielle arter langs den utbredte Entner-Doudoroff (ED) veien, selv om unntak er kjent 20. Detterettferdiggjør bruk av 13C-glukose som en pålitelig metabolsk sonde som gir en kobling mellom metabolitter av interesse og karbonkilden langs etablerte veier. Avhengig av den vitenskapelig spørsmålet andre substrater, dvs. 13 C-metan, 13 CO 2 eller planter hevet under en 13 CO2 atmosfære, kan brukes til å adressere metabolske aktiviteter. På dette punktet, presenterer vi protokollen brukt i metabolsk karakterisering av tarmen bakteriell fellesskap av en generalist insekt, nemlig S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Videre ble teknikk koplet til pyrosequencing, som igjen tillater identifisering av insekt tarmbakterie fellesskap med høy oppløsning og nøyaktighet. Som det viktigste substrat, ble 13 C-merket glukose benyttet under forsøkene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

Guts av de fleste insekter er bebodd av komplekse samfunn av symbiotiske nonpathogenic bakterier. Innenfor slike mikrobielle samfunn er det mulig å identifisere commensal eller mutualistic bakteriearter. De sistnevnte, har blitt observert å tjene flere funksjoner i insektet, dvs. hjelpe i insekt reproduksjon 1, øker immunresponsen 2, feromon produksjons 3, samt ernæring, inkludert syntese av essensielle aminosyrene 4, blant andre. På grunn av betydningen av disse foreningene, er mange anstrengelser er gjort for å karakterisere lokalsamfunnene ned til de enkelte medlemmene. Men de fleste av disse tiltakene ble enten basert på dyrkingsmetoder eller støttet seg på generering av 16S rRNA genet fragmenter som ble sekvensert for endelig identifisering. Dessverre er disse metoder bare identifisert de bakterielle arter som er tilstede i tarmene, og forutsatt ingen information på metabolsk aktivitet av mikroorganismene. Å karakterisere metabolsk aktive bakteriearter i tarmen av et insekt, brukte vi stabile isotop sondering (SIP) in vivo ansette 13 C-glukose som en universell substrat. Dette er et lovende kultur-fri teknikk som gjør det mulig for koblingen av mikrobielle phylogenies til deres spesielle metabolske aktivitet. Dette er mulig ved å spore stabile isotop-merket atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, slik som DNA og RNA 5. Inkorporering av 13 C isotoper i DNA øker tettheten av det merkede DNA sammenlignet med umerket (12 C) en. Til slutt er det 13 C-merket DNA-eller RNA separert ved densitets-gradient-ultrasentrifugering fra 12 C-umerket lignende en 6. Etterfølgende molekylær analyse av de separerte nukleinsyre isotopomers gir sammenhengen mellom metabolsk aktivitet og identiteten til arten. Her presenterer vi en protokoll som brukes til å karakterisere de metabolsk aktive bakterier i tarmen av en genera insekt (vår modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). De fylogenetisk analyse av DNA ble utført ved hjelp av pyrosequencing, som tillater høy oppløsning og nøyaktighet i identifisering av insekt tarmbakteriemiljøet. Som viktigste substrat, ble 13 C-merket glukose anvendt i eksperimentene. Substratet ble matet til insektene ved hjelp av en kunstig diett.

For å oppnå tilstrekkelig merking av metabolsk aktive bakterier tilstede i insekt tarmen, må insektet utsettes for de 13 C-rikt substrat for en tidligere optimalisert periode som er tilstrekkelig til å tillate separasjon av den merkede tyngre fraksjon lett fra den umerkede lysere en. I vårt tilfelle var 13 C-glucose supplert i kunstig diett i en endelig konsentrasjon på 10 mM i 1 time (figur 1A). Den samme mengde av normal glukose (figur 1B) ble levert i kuns...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Den aktive bakterie fellesskap forbundet med tarmen av Spodoptera littoralis, ble bestemt ved stabil-isotop-sentret (SIP) som er koplet til pyrosequencing. Ved hjelp av denne metoden, ble identifisering av metabolsk aktive bakterier arter i samfunnet gjort med høy oppløsning og presisjon.

Identifisering av metabolsk aktiv bakterier i tarmen av generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA stabile isotoper Verifiserer Bruke<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glukose

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisering av DNA Replication i Vertebrate Model System DT40 hjelp av DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISH Bruke Direkte merkede prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifisering av Post-translasjonell Modifikasjoner av Plant Protein komplekser

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunutfelling analyse for identifikasjon av Arabidopsis Protein-DNA interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Eksperimentell protokoll for bruke Drosophila som en virvelløse modellsystem for toksisitet Testing i laboratoriet

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Etablering av stabile binære kulturer av symbiotisk saccharibacteria fra munnhulen

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...