Name: identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Agradecemos Angelika Berg de assistência laboratorial. Este trabalho foi apoiado e financiado pela Sociedade Max Planck e da Escola de Comunicação Jena microbiana (JSMC).

1. Insect Criação <ol><li> Compre ou obter ovos garras de Spodoptera littoralis de seu próprio criação. Mantê-los em placas de Petri estéreis à temperatura ambiente (RT) até a eclosão. </li><li> Prepare a dieta artificial para insectos de criação como se segue: <ol><li> Mergulhe 500 g de feijão branco de terra durante a noite em 100 ml de água. </li><li> Adicionar 9,0 g de ácido ascórbico e 75 g de ágar a 1000 ml de H2O destilada e depois reduzi-lo. </li><li> Deixe a mistura a arre...

<ol>
	<li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction,+digestion,+and+immunity+processes+of+its+host,+the+tsetse+fly.">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li><li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore.">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note:+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone.">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses:+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera.">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li><li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota.">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li><li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endosymbionts+of+insects:+insights+from+comparative+genomics.">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li><li>Brune, A., VH, R. e. s. h., Card&#233;, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).</li><li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites.">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li><li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods.">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li><li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae.">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li><li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae.">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation.">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li><li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach.">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li><li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP.">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li><li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere.">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li><li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology.">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li><li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits:+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil.">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

O intestino da maioria dos insetos abriga uma comunidade microbiana rica e complexa, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas apresentar lá, superando as próprias células do hospedeiro, na maioria dos casos. Assim, o inseto intestino é um &quot;hot spot&quot; para diversas atividades microbianas, representando vários aspectos das relações microbianas, de patogênese para obrigar mutualismo 27. Embora muitos estudos têm descrito uma incrível variedade de comunidades microbiana...

Associações simbióticas Insect-bacterianos são conhecidos por um grande número de espécies de insetos 7. Nestas associações simbióticas, microrganismos desempenham um papel importante no crescimento e desenvolvimento de insectos. Os micróbios têm sido mostrados para contribuir para a reprodução de insectos 1, feromona biossíntese 3, nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais, 4, e a digestão de alimentos inacessível ao hospedeiro. Apesar da grande variedade de associações gut-bacteriana, muito menos se sabe sobre o papel funcional que desempenham em favor do inseto. Só no caso de as térmitas, a digestão simbiótica de lignocelulose realizada por procariotas, protozoários e fungos, tem sido amplamente estudada 8,9. Em contraste com isso, pouco se sabe sobre a associação simbiótica presente no intestino dos insetos generalistas, ou seja, o curuquerê, Spodoptera littoralis. Além disso, devido à sua mudança freqüente de plantas hospedeiras, em geralist insetos e seus intestino comunidades bacterianas associadas estão permanentemente expostos a novos desafios vinculados a seus hábitos alimentares consumir plantas com uma infinidade de fitoquímicos. Ao lado desta, o ambiente do intestino em lepidópteros, representa por si só um ambiente hostil para o crescimento de bactérias por causa do elevado pH do intestino 10. Particularmente, no caso de S. littoralis, que varia de 10,5 no intestino anterior, ca. 9 no intestino médio para um pH de cerca de 7 no intestino posterior 11. Por outro lado, a comunidade bacteriana associada com o intestino de S. littoralis é simples. Tang, Freitak, et al. 12 relataram um máximo de 36 filotipos pertencentes a um total de 7 espécies de bactérias diferentes, como os únicos membros da comunidade bacteriana associada a esse inseto. Além disso, qualquer processo de criação complicado é necessário para o crescimento dos insectos no laboratório. Além disso, este e o curto ciclo de vida do insecto facilitar multi-gestudos enerational, transformando esta espécie em um sistema modelo ideal para o estudo de interações gut-micróbio. Com o advento das tecnologias de seqüenciamento baseadas na PCR, o número de estudos que tratam de intestino biota de vários organismos (ou seja, os seres humanos, insetos, ou organismos marinhos) tem aumentado. Além disso, os resultados são independentes do isolamento e cultivo das bactérias intestinais abrigado como no passado. Quase 99% das bactérias não são cultiváveis ​​e a simulação das condições ambientais prevalecentes no intestino é difícil 12. Usando PCR, os fragmentos de genes de rRNA 16S (um gene marcador filogenético amplamente utilizado entre as bactérias) pode ser amplificado de forma selectiva um molde de ADN mista de comunidades bacterianas do intestino, sequenciados, e clonado. Com essas informações, o usuário é capaz de identificar as espécies de bactérias depois de recuperar as informações da seqüência de bases de dados públicas 13,14. No entanto, a sequenciação de abordagens para descrever bacterianacomunidades continuam a ser insuficientes, devido à falta de informações sobre a contribuição metabólica intrínseca de cada espécie dentro da comunidade. Stable-isótopo sondagem (SIP) é uma técnica sem cultura promissor. Ele é frequentemente usado em microbiologia ambiental para analisar filogenias microbianas associadas a determinadas atividades metabólicas. Isto é conseguido através do rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como os ácidos gordos derivados de fosfolípidos, DNA e RNA de 5. Ao considerar os ácidos nucleicos, a metodologia baseia-se na separação de 13 de ADN marcado com C ou de ARN a partir do ADN não marcado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de 6. Devido a esta ligação directa entre o marcador de ADN e actividade metabólica, uma análise molecular jusante dos ácidos nucleicos identificam as espécies e fornece informações sobre as actividades metabólicas. Além disso, a combinação de ADN-SIP e pyrosequencing como aplicado porPilloni, von Netzer, 15 et al., Permite uma identificação simples e sensível em particular da espécie bacteriana presente na 13 fracção pesada de ADN marcada com C. Até agora, esta técnica tem sido aplicada para descrever as comunidades bacterianas envolvidas em processos biogeoquímicos em solo sob aeróbicos e anaeróbicos condições 16,17 18,19. Além do uso em ciências ambientais, a técnica tem sido aplicada em ciências médicas como relatado por Reichardt, et al. 5, que descreveu as atividades metabólicas dos diferentes grupos filogenéticos da microbiota intestinal humana em resposta a um carboidrato digerível. Aqui usamos 13 C-glucose em &quot;rótulo&quot; o ADN das espécies de bactérias metabolicamente activas no intestino. A glicose é um açúcar utilizado pela maioria das espécies bacterianas, ao longo da via generalizada Entner-Doudoroff (ED), embora excepções são conhecidas 20. Estejustifica o uso de 13 C-glicose como uma sonda metabólica confiável que fornece uma ligação entre metabólitos de interesse e a fonte de carbono ao longo de caminhos estabelecidos. Dependendo da causa científica, outros substratos, ou seja, 13 C-metano, 13 CO 2, ou plantas cultivadas sob uma atmosfera de 13 CO 2, podem ser usadas para tratar as actividades metabólicas. Neste ponto, apresentamos o protocolo aplicado na caracterização metabólica da comunidade bacteriana do intestino de um inseto generalista, ou seja, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Além disso, a técnica foi acoplada a pyrosequencing, que por sua vez permite a identificação da comunidade bacteriana do intestino de insectos, com alta resolução e precisão. Como o substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizado durante os experimentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

Guts da maioria dos insetos são habitadas por comunidades complexas de bactérias não patogênicas simbióticas. Dentro dessas comunidades microbianas é possível identificar comensais ou bactérias mutualistas espécie. Os últimos, têm sido observados para servir várias funções ao inseto, ou seja, ajudar na reprodução de insetos 1, aumentando a resposta imune 2, produção de feromônio 3, bem como a nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais 4, entre outros. Devido à importância dessas associações, foram feitos muitos esforços para caracterizar as comunidades de baixo para os membros individuais. No entanto, a maioria desses esforços foram ou baseados em métodos de cultivo ou contado com a geração de fragmentos de genes 16S rRNA que foram seqüenciados para a identificação final. Infelizmente, estas abordagens apenas identificadas as espécies de bactérias presentes no intestino e, desde que não informatião sobre a actividade metabólica dos microrganismos. Para caracterizar a espécie de bactérias metabolicamente activas no intestino de um insecto, que utilizado isótopo estável sondagem (SIP) in vivo utilizando 13 C-glucose como um substrato universal. Esta é uma técnica de cultura livre de promissor que permite a ligação de Filogenias microbianas para a sua actividade metabólica específica. Isto é possível por rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como o ADN e ARN 5. A incorporação de 13 C isótopos para DNA aumenta a densidade do ADN marcado em comparação com a não marcado (12 C) uma. No final, o ADN de 13 C-rotulado ou RNA é separado por ultracentrifugação de gradiente de densidade a partir de 12-C sem rótulo semelhante um 6. A análise molecular subsequente dos isotopómeros ácidos nucleicos separados proporciona a ligação entre a actividade metabólica e a identidade das espécies. Aqui, apresentamos o protocolo usado para caracterizar as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto generalista (nosso sistema modelo), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). A análise filogenética do DNA foi feito utilizando pyrosequencing, o que permitiu alta resolução e precisão na identificação do intestino do insecto comunidade bacteriana. Como substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizada nas experiências. O substrato foi alimentado aos insectos por meio de uma dieta artificial.

Para alcançar rotulagem suficiente das bactérias metabolicamente activas presentes no intestino do insecto, o insecto pode ser exposto ao 13 substrato rico em C, durante um período previamente optimizado suficiente para permitir a separação da fracção mais pesada marcado facilmente do não marcado mais leve. No nosso caso, 13 C-glucose foi suplementado na dieta artificial a uma concentração final de 10 mM durante 1 dia (Figura 1A). A mesma quantidade de glicose normal <str...

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Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.

Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

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Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacterias simbióticas da Cavidade Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...