Name: identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Vi tackar Angelika Berg för laboratorieassistans. Detta arbete stöddes och finansierades av Max Planck-sällskapet och Jena Skolan för Microbial Communication (JSMC).

1. Insekt Uppfödning <ol><li> Köpa eller få ägg kopplingar av Spodoptera littoralis från din egen uppfödning. Behåll dem i sterila petriskålar i rumstemperatur (RT) till kläckning. </li><li> Förbered artificiella dieten för insekterna föder upp enligt följande: <ol><li> Blöt 500 g malda vita bönor över natten i 100 ml vatten. </li><li> Lägg 9,0 g askorbinsyra och 75 g agar till 1000 ml destillerat H2O och därefter koka den. </li><li> Låt blandningen svalna och när det stelnar (t...

<ol>
	<li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction,+digestion,+and+immunity+processes+of+its+host,+the+tsetse+fly.">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li><li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore.">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note:+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone.">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses:+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera.">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li><li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota.">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li><li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endosymbionts+of+insects:+insights+from+comparative+genomics.">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li><li>Brune, A., VH, R. e. s. h., Card&#233;, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).</li><li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites.">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li><li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods.">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li><li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae.">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li><li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae.">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation.">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li><li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach.">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li><li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP.">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li><li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere.">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li><li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology.">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li><li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits:+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil.">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

Tarmen hos de flesta insekter hyser en rik och komplex mikrobiella, typiskt 10 7 -10 9 prokaryota celler lämna där, outnumbering värdens egna celler i de flesta fall. Således är insekten tarmen en &quot;hot spot&quot; för olika mikrobiella aktiviteter, som representerar flera aspekter av mikrobiella relationer, från patogenes att obligat mutualism 27. Även om många studier har beskrivit ett fantastiskt utbud av insekts tarmen mikrobiella samhällen, karaktärisering av den metab...

Insect-bakteriella symbiotiska föreningar är kända för ett stort antal insektsarter 7. I dessa symbiotiska föreningar, mikroorganismer spelar en viktig roll i tillväxten och utvecklingen av insekter. Mikrober har visat sig bidra till en insekt reproduktion 1, feromon biosyntes 3, näring, inklusive syntes av essentiella aminosyrorna 4 och digerering av otillgängliga mat till värden. Trots det stora utbudet av gut-bakteriella föreningar, än mindre är känt om den funktionella roll de spelar till förmån för insekten. Endast i fall av termiter, det symbiotiska digestion av lignocellulosa utförs av prokaryoter, protozoer och svampar, har studerats ingående 8,9. I motsats till detta, är lite känt om det symbiotiska förening som finns i tarmen av generalist insekter dvs bomulls leafworm, littoralis Spodoptera. Dessutom på grund av sin täta förskjutning av växtvärdar, allmänist insekter och deras gut associerade bakteriesamhällen är ständigt utsatta för nya utmaningar kopplade till deras matvanor krävande anläggningar med en uppsjö av fytokemikalier. Bredvid detta tarmen miljö lepidopterans representerar i sig en hård miljö för tillväxt av bakterier på grund av den höga gut pH 10. Särskilt i fallet med S. littoralis, varierar den från 10,5 i framtarmen, ca. 9 i midgut att pH-värdet nästan 7 i hindgut 11. Å andra sidan, den bakteriella gemenskap associerad med tarmen hos S. littoralis är enkel. Tang, Freitak, et al. 12 rapporterade högst 36 phylotypes tillhör totalt 7 olika bakteriearter som de enda medlemmarna av bakteriesamhället i samband med denna insekt. Förutom detta, är ingen komplicerad uppfödning förfarande krävs för insekters tillväxt i laboratoriet. Dessutom är det här, och den korta livscykel insekt lätta multi-generational studier, svarvning denna art i ett perfekt modellsystem för att studera gut-mikrob-interaktioner. Med tillkomsten av PCR-baserade sekvensering teknik, har flera studier som behandlar gut biota av flera organismer (dvs. människor, insekter, eller marina organismer) ökat. Dessutom är resultaten oberoende av isolering och odling av tarm hyste bakterier som tidigare. Nästan 99% av bakterier är inte förökas och simulering av de miljöförhållanden som råder i tarmen är svår 12. Genom att använda PCR, kunde 16S rRNA genfragment (en allmänt använd fylogenetisk gen markör bland bakterier) selektivt amplifieras från en blandad DNA-mall av tarmbakteriesamhällen, sekvenseras och klonas. Med denna information kan användaren identifiera bakteriearter efter hämtning av sekvensinformation från offentliga databaser 13,14. Ändå närmar sig sekvensering för att beskriva bakteriellsamhällen förblir otillräckliga på grund av bristande information om den inneboende metaboliska bidrag av enskilda arter inom gemenskapen. Stabil-isotop sondering (SIP) är ett lovande kultur-fri teknik. Den används ofta i miljömikrobiologi för att analysera mikrobiella fylogenier kopplade till speciella metaboliska aktiviteter. Detta uppnås genom att spåra stabila isotopmärkta atomer från substrat i mikrobiella biomarkörer, såsom fosfolipid härrörande från fettsyror, DNA och RNA 5. När man överväger nukleinsyror, är den metod som baseras på separation av 13 C-märkt DNA eller RNA från den omärkta DNA genom densitet-gradient ultracentrifugering 6. På grund av denna direkta förbindelse mellan den DNA-etikett och metabolisk aktivitet, en nedströms molekylär analys av nukleinsyrorna identifierar arten och ger information om metaboliska aktiviteter. Dessutom är kombinationen av DNA-SIP och pyrosekvensering som tillämpas avPilloni von Netzer, et al. 15, medger en viss enkel och känslig identifiering av bakteriearter som finns i den tunga 13 C-märkt DNA-fraktionen. Hittills har denna teknik använts för att beskriva de bakteriella samhällen som deltar i biogeokemiska processer i marken under aeroba 16,17 och anaeroba förhållanden 18,19. Vid sidan av användningen i miljövetenskap, har tekniken använts i medicinska vetenskaper som rapporterats av Reichardt, et al. 5, som beskrev den metaboliska aktiviteter av olika fylogenetiska grupper av den mänskliga tarmfloran som svar på en icke-smältbar kolhydrat. Här använder vi 13 C-glukos till &quot;etikett&quot; DNA av de metaboliskt aktiva bakteriearter i tarmen. Glukos är en sockerart som används av de flesta bakteriearter längs den utbredda Entner-Doudoroff (ED) vägen, även om undantag är kända 20. Dettamotiverar användningen av 13 C-glukos som en pålitlig metabolisk sond som ger ett samband mellan metaboliter av intresse och kolkälla längs etablerade vägar. Beroende på den vetenskapliga frågan, andra substrat, dvs 13 C-metan, 13 CO2, eller växter som fötts upp under en 13 CO 2 atmosfär, kan användas för att behandla metaboliska aktiviteter. Vid denna punkt, presenterar vi det protokoll som används i den metaboliska karakterisering av tarmen bakteriell gemenskap av en generalist insekt, nämligen S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Dessutom var den teknik kopplad till pyrosekvensering, vilket i sin tur gör det möjligt att identifiera insekts tarm bakteriell gemenskap med hög upplösning och precision. Eftersom det huvudsakliga substratet var 13 C-märkt glukos användes under experimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

Guts flesta insekter är bebodda av komplexa samhällen av symbiotiska icke-patogena bakterier. Inom sådana mikrobiella samhällen är det möjligt att identifiera kommen eller mutualistic bakteriearter. De senare, har observerats att tjäna flera funktioner till insekten, det vill säga att hjälpa i insekts reproduktion 1, öka immunsvaret 2, feromonproduktion 3, samt näring, däribland syntesen av essentiella aminosyror 4, bland annat. På grund av betydelsen av dessa föreningar, har många ansträngningar gjorts för att karakterisera de samhällen ned till de enskilda medlemmarna. Men de flesta av dessa ansträngningar var antingen baserade på odlingsmetoder eller förlitat sig på generering av 16S rRNA genen fragment som sekvenserades för slutlig identifiering. Tyvärr är dessa metoder bara identifierat de bakteriearter som finns i tarmen och under förutsättning att ingen informatjonen på den metaboliska aktiviteten hos mikroorganismerna. För att karakterisera de metaboliskt aktiva bakteriearter i tarmen hos en insekt, använde vi stabil isotop sondering (SIP) in vivo med användning av 13 C-glukos som en universell substrat. Detta är ett lovande kultur fria teknik som tillåter bindningen av mikrobiella fylogenier till deras speciella metaboliska aktiviteten. Detta är möjligt genom att spåra stabila isotopmärkta atomer från substrat i mikrobiella biomarkörer, såsom DNA-och RNA-5. Införlivandet av 13 C-isotoperna i DNA ökar densiteten av det märkta DNA: t i förhållande till den omärkta (12 C) ett. I slutändan är den 13 C-märkt DNA eller RNA separerades genom densitetsultracentrifugering från 12 C-omärkt liknande en 6. Efterföljande molekylär analys av de separerade nukleinsyrasekvenser isotopomererna tillhandahåller anslutningen mellan metabolisk aktivitet och identiteten av arten. Här presenterar vi det protokoll som används för att karakterisera de metaboliskt aktiva bakterier i tarmen hos en generalist insekt (vårt modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Den fylogenetisk analys av DNA utfördes med användning av pyrosekvensering, som tillät hög upplösning och precision vid identifiering av insekts gut bacterial community. Som huvudsakliga substrat, var 13 C-märkt glukos användes i experimenten. Substratet matades till de insekter med hjälp av en konstgjord diet.

För att uppnå tillräcklig märkning av de metaboliskt aktiva bakterier som finns i insekts tarmen måste insekten att exponeras för de 13 C-rika substrat för ett tidigare optimerade period som är tillräcklig för att möjliggöra separation av det märkta tyngre fraktionen lätt från den omärkta ljusare en. I vårt fall var 13 C-glukos kompletterat i den konstgjorda dieten vid en slutlig koncentration av 10 mM under 1 dag (Figur 1A). Samma mängd normal glukos (Fig...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Den aktiva bakteriesamhället i samband med tarmen av Spodoptera littoralis, bestämdes med stabil-isotop-sondering (SIP) kopplad till pyrosekvensering. Med användning av denna metod, var identifieringen av de metaboliskt aktiva bakteriespecies i samhället gjort med hög upplösning och precision.

Identifiering av metaboliskt aktiva bakterier i tarmen hos Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA stabil isotop Probing Använda<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glukos

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extrahera DNA från tarmen Mikroberna i Termite (Zootermopsis Angusticollis) och visualisering Gut Mikroberna

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA Stabil-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisering av DNA-replikering i ryggradsdjur modellsystem DT40 använda tekniken DNA Fiber

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISK Använda Direkt märkta prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimentellt protokoll för att använda Drosophila som en ryggradslösa modellsystem för toxicitetstester i laboratoriet

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Etablera stabila binära kulturer av symbiotiska saccharibacteria från munhålan

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...