Name: programming stem cells for therapeutic angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles
Uploaded: 2013-09-27T16:00:00
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Gli autori vorrebbero riconoscere American Heart Association Nazionale Scientist Development Grant (10SDG2600001), Stanford Bio-X interdisciplinare Programma di Iniziativa e Stanford Medical Scholars Program Research per il finanziamento.

1. Polymer Synthesis <ol><li> In una cappa aspirante, pesare 3.523 mg di butandiolo diacrylate (C) e trasferire in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta. </li><li> Preriscaldamento 5-ammino-1-pentanolo (32) a 90 ° C per solubilizzare il sale, poi in una cappa aspirante, pesare 1,533 mg 32 e aggiungere alla fiala di scintillazione contenente C. Questo metodo si tradurrà in un rapporto molare C: 32 = 1:1,2. </li><li> Porre immediatamente il flaconcino contenente entrambe le soluzioni su un piat...

<ol>
	<li>Deveza, L., Choi, J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+for+treating+cardiovascular+diseases.">Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases.</a> Theranostics. 2, 801-814 (2012).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+stem+cells+for+enhanced+angiogenesis+using+biodegradable+polymeric+nanoparticles.">Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).</li><li>Mangi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+modified+with+Akt+prevent+remodeling+and+restore+performance+of+infarcted+hearts.">Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts.</a> Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+bone+healing+based+on+ex+vivo+gene+therapy+using+human+muscle-derived+cells+expressing+bone+morphogenetic+protein+2.">Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2.</a> Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).</li><li>Park, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+may+be+uniquely+suited+for+combined+gene+therapy+and+cell+replacement:+Evidence+from+engraftment+of+Neurotrophin-3-expressing+stem+cells+in+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury.</a> Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+adult+and+embryonic+cell-derived+stem+cells+using+biodegradable+nanoparticulate+polymeric+vectors.">Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors.</a> Gene Ther. 16, 533-546 (2009).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> J. Vis. Exp. , e1035 (2009).</li><li>Ceradini, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+trafficking+is+regulated+by+hypoxic+gradients+through+HIF-1+induction+of+SDF-1.">Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1.</a> Nat. Med. 10, 858-864 (2004).</li><li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+mesenchymal+stem+cell+tropism+for+tumor+and+wounding+microenvironments+using+in+vivo+bioluminescent+imaging.">Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging.</a> Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+end-groups+of+linear+polymer+determine+cell-type+gene-delivery+efficacy.">Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).</li><li>Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+base+polymer+hydrophobicity+and+end-group+modification+on+polymeric+gene+delivery.">Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery.</a> Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(&#946;-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(&#946;-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Eltoukhy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+of+amine+end-modified+poly(beta-amino+ester)s+on+gene+delivery+efficiency+and+toxicity.">Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity.</a> Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).</li><li>Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+safe,+non-viral+therapeutic+gene+expression+in+humans.">Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).</li><li>Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+insertional+mutagenesis+insights.">Gene therapy insertional mutagenesis insights.</a> Science. 303, 333 (2004).</li></ol>

Qui riportiamo un metodo per programmare le cellule staminali adulte per iperespressione di fattori terapeutici utilizzando non-virali, nanoparticelle biodegradabili. Questa piattaforma è particolarmente utile per il trattamento di malattie in cui le cellule staminali possono naturalmente casa, come ischemia e cancro. 9-10 Inoltre, la piattaforma di trasferimento genico non virale permette sovraespressione transiente di fattori terapeutici, che è più adatto per la rigenerazione dei tessuti e ferita process...

L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di promuovere l&#39;angiogenesi terapeutica con cellule staminali non-virale programmati sovraespressione fattori terapeutici presso il sito di ischemia. Le cellule staminali sono state modificate ex vivo prima con nanoparticelle biodegradabili sintetizzate in laboratorio e poi trapiantate in un modello murino di ischemia degli arti posteriori per convalidare il loro potenziale per migliorare l&#39;angiogenesi e recupero del tessuto. Crescita vascolare controllato è un componente importante di rigenerazione tissutale successo, così come per il trattamento di varie malattie ischemiche come ictus, ischemia e infarto del miocardio. Diverse strategie sono state sviluppate per promuovere la crescita vascolare, inclusa la consegna fattore di crescita e terapia cellulare. 1 Nonostante l&#39;efficacia osservata nei modelli animali di malattia, questi metodi ancora affrontare limitazioni, quali la necessità di dosi sovrafisiologici per la consegna fattore di crescita, o insufficiente paracrinorilasciare dalle cellule soli. Una strategia potenziale per superare le limitazioni di cui sopra è di combinare terapia con cellule staminali e terapia genica, per cui le cellule staminali sono geneticamente programmati ex vivo prima del trapianto di iperespressione fattori terapeutici desiderabili. Questo approccio è stata dimostrata in vari modelli di malattie, tra cui l&#39;ischemia degli arti posteriori 2, malattie cardiache 3, guarigione ossea 4 e 5 danno neuronale, ecc. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche di terapia genica si basano su vettori virali, che sono associati con problemi di sicurezza quali il potenziale immunogenicità e mutagenesi inserzionale. Biomateriali mediate trasferimento genico non virale possono superare questi limiti, ma spesso soffrono di bassa efficienza di trasfezione. Per accelerare la scoperta di nuovi biomateriali per un efficiente trasferimento genico non virale, studi recenti hanno impiegato chimica combinatoria e ad alta produttività approccio di screening. Biblioteche polimero biodegradabile come il poli (es β-amminotri) (PBAE) sono stati sviluppati e schermato, che ha portato alla scoperta di polimeri leader con marcatamente maggiore efficienza di trasfezione rispetto alle tradizionali controparti vettori polimerici. 6-7 Qui, si descrive la sintesi di PBAE e verifica della loro capacità di trasfezione le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) in vitro, seguita da successiva trapianto di ADSCs geneticamente modificati iperesprimenti fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) in un modello murino di ischemia hindlimb . I risultati sono stati valutati tenendo traccia destino cellulare utilizzando l&#39;imaging bioluminescenza, valutando riperfusione mediante perfusione tissutale laser Doppler Imaging (LDPI), e determinando l&#39;angiogenesi e tessuti di salvataggio da istologia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
				Name of the Reagent</td>
			<td>
				Company</td>
			<td>
				Catalogue Number</td>
			<td>
				Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMEM</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				11965</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Fetal Bovine Serum</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				10082</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				15070</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>
				Peprotech</td>
			<td>
				100-18B</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				1,4-Butanediol Diacrylate (90%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				411744</td>
			<td>
				Acronym: C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				5-amino-1-pentanol (97%)</td>
			<td>
				Alfa Aesar</td>
			<td>
				2508-29-4</td>
			<td>
				Acronym: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Tetraethyleneglycoldiamine &gt;99%)</td>
			<td>
				Molecular Biosciences</td>
			<td>
				17774</td>
			<td>
				Acronym: 122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Sodium Acetate</td>
			<td>
				G-Biosciences</td>
			<td>
				R010</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				14190-144</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Tetrahyofuran Anhydrous (&gt;99.9%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				401757</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Diethyl Ether Anhydrous (&gt;99%)</td>
			<td>
				Fisher Scientific</td>
			<td>
				E138-4</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMSO Anhydrous (&gt;99.9%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				276855</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Gelatin</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				G9391</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Trypsin-EDTA</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				25200</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				D-luciferin</td>
			<td>
				GoldBio</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Optimal Cutting Temperature (O.C.T)</td>
			<td>
				Tissue-Tek</td>
			<td>
				4583</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td>
				BD Pharmingen</td>
			<td>
				550274</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Alexa Fluor 594 anti-rat IgG</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				A11007</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

	&nbsp;

programming stem cells for therapeutic angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles

Crescita vascolare controllata è fondamentale per la rigenerazione tissutale successo e la guarigione delle ferite, così come per il trattamento di malattie ischemiche come ictus, infarto o arteriopatie periferiche. Consegna diretta di fattori di crescita angiogenici ha il potenziale per stimolare la crescita di nuovi vasi sanguigni, ma è spesso associata a limitazioni come la mancanza di un orientamento e di breve emivita in vivo. La terapia genica offre un approccio alternativo, fornendo geni codificanti fattori angiogenici, ma spesso richiede l&#39;utilizzo virus, ed è limitata da problemi di sicurezza. Qui si descrive una strategia recentemente sviluppato per stimolare la crescita vascolare dalle cellule staminali di programmazione per iperespressione di fattori angiogenici in situ utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. In particolare la nostra strategia utilizzato cellule staminali come vettori sfruttando la loro capacità di migrare verso i tessuti ischemici in vivo. Utilizzando i vettori polimerici ottimizzate, derivate da tessuto adiposoLe cellule staminali sono state modificate per iperespressione di un gene che codifica angiogenico fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Abbiamo descritto i processi per la sintesi del polimero, la formazione di nanoparticelle, trasfezione delle cellule staminali in vitro, come pure metodi per convalidare l&#39;efficacia delle cellule staminali-VEGF esprimendo per promuovere l&#39;angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Su mescolando, il polimero carico positivamente (C32-122) e caricati negativamente plasmide DNA auto-assembla in nanoparticelle. Formazione di nanoparticelle può essere confermata mediante analisi elettroforetica ossia la complessazione tra C32-122 e DNA plasmidico impedirà mobilitazione del DNA durante l&#39;elettroforesi. Il polimero serve come reagente di trasfezione per facilitare un migliore assorbimento del DNA nelle cellule bersaglio e la successiva espressione di proteine ​​che codificano ...

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Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l&#39;efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l&#39;angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

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Research

JoVE Journal

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