Name: enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model
Uploaded: 2013-10-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model at JoVE.com

Dominic Mills fick stöd av ett Bloomsbury Högskolor doktorand (2007-2010). Författarna vill tacka både Ozan Gundogdu och Abdi Elmi för deras hjälp i utvecklingen av VDC-modeller.

Ett. Tillväxt av IEC Enskiktslagren på Special 0,4 um filter <ol><li> Kultur Caco-2-celler i Dulbeccos modifierade essentiella media (DMEM) kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 1% (volym / volym) icke-essentiella aminosyror i en standard vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C i 5% CO2 och 95% luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECS per 0,4 pm filtrera och växa till polarisering över 21 dagar, byta media var 2-3 dagar. </li><li> Mät TEER...

<ol>
	<li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment.">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li><li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo.">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li><li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+century+of+Campylobacter+research:+recent+advances,+new+opportunities+and+old+problems.">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li><li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni:+molecular+biology+and+pathogenesis.">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li><li>Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17.">Chapter 17.</a> Campylobacter. , 297-313 (2008).</li><li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli.">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li><li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures.">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li><li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface.">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li><li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms.">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li><li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells.">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li><li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho/Ras-associated+proteins+in+cellular+signaling.">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li></ol>

Användningen av cellodling in vitro metoder för att studera interaktioner mellan bakteriella patogener med värdceller är en teknik som ofta används i många forskningslaboratorier. Men som sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden, dessa in vitro-modeller inte kan korrekt representera in vivo-miljö i vilken värdpatogen interaktion äger rum. Den används ofta in vitro infektion modeller är speciellt olämpligt för att studera mikroaerofil C. jejuni</e...

Växelverkan av bakteriella patogener med värdceller har undersökts utförligt med in vitro-metoder cellkultur. Med användning av sådana cellodlingsanalyser, bakteriell vidhäftning till värdceller, identifiering av receptorer värdcell värdcell signalvägar och bakteriell invasion av värdceller har alla studerats i detalj, vilket resulterade i många viktiga iakttagelser. Men sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden som inte kan vara representativt för den in vivo-miljö. En viktig begränsning av in vitro-modeller används för att studera gastrointestinala infektioner är att odlingsbetingelser inklusive höga syrenivåer i allmänhet gynnar eukaryot cell överlevnad. Dock förhållandena i tarmlumen kommer att vara nästan anaeroba. Enteropatogener i en mycket låg syrehalt miljö uttrycka virulensgener vars uttryck förändras under aeroba förhållanden 2. Som sådan, erhölls data med hjälp av standard cellodling modeller may ge en felaktig indikation av bakteriella interaktioner med värdceller. Campylobacter jejuni är den ledande smittämnen av bakteriell akut gastroenterit i världen, med symtom som varierar från mild diarré till svår inflammatorisk enterit. Majoriteten av C. jejuni infektioner resulterar i okomplicerad gastroenterit, men C. jejuni är också den vanligaste identifierade smittämnet i perifera neuropatier inklusive Guillain-Barrés syndrom (GBS). I Storbritannien, är det uppskattas att det finns över 500.000 fall av enterit orsakad av C. jejuni infektion varje år med en förväntad kostnad för den brittiska ekonomin på £ 580.000.000. I utvecklingsländerna, C. jejuni är en ledande orsak till dödlighet bland barn. Trots den obestridliga betydelse för Campylobacter-infektion och årtionden av forskning, inbegripet grundlig genomik-baserade analyser, C. jejuni patogenes är fortfarande dåligt understood, till skillnad från andra enterala patogener, såsom Salmonella, Escherichia coli, Shigella och Vibrio cholerae. Avsaknaden av en praktisk liten djurmodell är en viktig orsak till detta 3. Även den ofta används in vitro infektion modeller är mer olämplig för att studera mikroaerofil C. jejuni än för andra tarmpatogener som är fakultativa anaerober. Medan C. jejuni är erkänd som en invasiv patogen, mekanismerna för C. jejuni invasion av tarmepitelceller (IECS) är fortfarande oklart 4,5. C. jejuni invasion har visat sig vara beroende av antingen microfilaments, mikrotubuli, en kombination av båda eller ingen 5. Den förvirring i detta område är sannolikt beroende på användningen av olämplig in vitro analysbetingelser. Ett antal olika cellodlingsanalyser har använts för att undersöka växelverkan av C. jejunimed värdceller. Caco-2 6, har INT 407 7, och T84 8 cellinjer alla använts för att studera adhesion och invasion hos olika C. jejuni-stammar. Emellertid, nivåerna av bakteriell adhesion och invasion för C. jejuni med IECS är dramatiskt lägre än för andra tarmpatogener 9. Den samodling av C. jejuni med IECS utförs normalt i en CO2-inkubator under betingelser nära atmosfäriska syrenivåer, krävs för överlevnaden av IECS. C. jejuni genuttryck kommer att vara mycket annorlunda i omgivning med låg syrehalt av intestinala lumen jämfört med atmosfäriska syreförhållanden. Användningen av en vertikal diffusionskammare (VDC) har utvecklats som medger samodling av bakterier och värdceller under olika medellång och förhållanden gas 1,10,11. Detta system efterliknar förhållandena i den mänskliga tarmen där bakterier kommer att under förhållanden mycket låg syrehalt medan vävnad kommer förses med syrgas från blodet. Polariserade IEC monoskikt odlade i speciella 0,4 xm filter placerades i en VDC skapa en apikal och basolaterala fack, som var för sig fylldes med bakteriellt buljong och cellodlingsmedium respektive (Figur 1). Den VDC placerades i den variabla atmosfären inkubator innehållande 85% N 2, 5% O2, och 10% CO2 vid 37 ° C, som representerar optimala förhållanden för C. jejuni. Den apikala fack lämnades öppen och exponeras för mikroaerobisk atmosfären inuti den variabla atmosfären inkubatorn, medan det förseglade basolaterala facket var levereras med syre genom konstant administrering av 5% CO 2/95% O 2 gasblandning med ett utloppsrör förhindrar ackumulering av trycket . Caco-2-cell överlevnad och cellslager integritet under dessa betingelser bekräftades genom övervakning av transepithelial electrical motstånd (TEER) över monolagret över 24 timmar för att demonstrera överlevnad Caco-2 cellmonoskiktet och fysisk separation av de apikala och basolaterala fack under låga syreförhållanden i apikala facket. Den TEER av monoskikt i VDCs upprätthålls i variabeln atmosfären inkubator (mikroaerob förhållanden) och i en standard cellkultur CO2-inkubator (aeroba betingelser) visade inga signifikanta skillnader, vilket indikerar integritet av cellmonoskiktet under olika atmosfäriska förhållanden 1. Under mikroaerob förhållanden, fortsatt tight junctions närvarande och fördelas jämnt mellan de cellkantlinjer med en occludin färgningsmönster liknande celler upprätthålls under aeroba förhållanden 1. De interaktioner C. jejuni med Caco-2 och T84 celler i VDC undersöktes genom att bedöma bakteriell interaktion (adhesion och invasion) och invasion. Två olika C. jejuni vildtyp strains användes 1. C. jejuni 11168H är en hypermotile derivat av den ursprungliga sekvensen stam NCTC11168. Den 11168H stammen visar mycket högre kolonisering nivåer i en chick kolonisering modell och betraktas därmed en lämplig stam att använda för värdpatogen interaktionsstudier. 81-176 är en mänsklig isolera och är en av de mest invasiva studerats ingående laboratoriestammar. C. jejuni-stammar tillsattes till den apikala avdelningen av en VDC under antingen mikroaerob eller aeroba förhållanden. Vi observerade högre priser för både interaktion och invasion registrerades för C. jejuni enligt mikroaerob villkor 1. Den ökade C. jejuni interaktioner inte var på grund av en ökning av antalet bakterier i mikroaerob villkor 1. Dessa data stöder vår hypotes att den omgivning med låg syrehalt i den apikala avdelningen av VDC förbättrar bakterier-värd interaktioner och indikerar att de invasiva egenskaper hos C. jejuni är incrlättade under dessa förhållanden. Detta var den första rapporten om användningen av VDC modell för att studera en invasiv bakteriell patogen och betonar betydelsen av att utföra in vitro infektion analyser under förhållanden som närmare efterlikna in vivo-situationen. VDC-modellen kan användas för att studera värd-patogen interaktioner för många olika bakteriearter.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0001</td>
			<td>Manifold &#38; six Snapwell chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapwell filters (pore size 0.4 &#956;m)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPA Lightwave II spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-3003-72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model

Växelverkan av bakteriella patogener med värdceller har undersökts utförligt med in vitro-metoder cellkultur. Men som sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden, dessa in vitro-modeller inte kan korrekt representera in vivo-miljö i vilken värdpatogen interaktion äger rum. Vi har utvecklat en in vitro modell av infektion som tillåter samodling av bakterier och värdceller under olika medelstora och villkor gas. Den vertikala Diffusionskammaren (VDC) modell efterliknar förhållandena i den mänskliga tarmen där bakterier kommer att vara under förhållanden med mycket låg syrehalt medan vävnad kommer förses med syrgas från blodet. Placering polariserade intestinala epitelceller (IEC) monolager odlas i Snapwell skär in i en VDC skapar separata apikala och basolaterala fack. Den basolaterala facket fylls med cellodlingsmedium, förseglades och perfusion med syre wHilst apikala facket fylls med buljong, hålls öppna och inkuberas under mikroaerob förhållanden. Både Caco-2 och T84 IECS kan upprätthållas i VDC under dessa betingelser utan några uppenbara skadliga effekter på cellöverlevnad eller monoskikt integritet. Samodling experiment med olika C. jejuni vildtyp stammar och olika IEC linjer i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala facket resultera reproducerbart i en ökning av det antal samverkande (nästan 10-faldig) och intracellulära (nästan 100-faldig) bakterier jämfört med aeroba odlingsbetingelser ett. Den miljö som skapas i VDC modellen närmare efterliknar miljön möter C. jejuni i den mänskliga tarmen och betonar vikten av att utföra in vitro infektion analyser under förhållanden som närmare efterlikna in vivo verkligheten. Vi föreslår att användningen av VDC-modellen kommer att möjliggöra nya tolkningar av samspelet satsalan bakteriella patogener och värdceller.

Samodling experiment utförda med ett C. jejuni vildtypsstam och IECS i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala avdelningen har visat en ökning av antal samverkande (nästan 10-faldig) och intracellulära (nästan 100-faldig) bakterier jämfört med aeroba odlingsbetingelser i en tid -beroende sätt 1. Denna observation var reproducerbar använder två olika C. jejuni vildtyp stammar (11168H och 81-176) och två olika IEC linjer (Caco-2 och T84), belyser giltigheten av VDC-...

Watch this Scientific Journal Video about Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model at JoVE.com

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Utföra cellkulturförsök för att undersöka bakteriell adhesion och invasion under aeroba förhållanden är oftast representativt för den<em&gt; In vivo</em&gt; Miljö. En vertikal diffusionskammare modell tillåter studie av interaktion mellan humant patogen<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Med tarmepitelceller enligt mer<em&gt; In vivo</em&gt;-Liknande förhållanden, vilket resulterar i ökad bakteriell invasion.

Enteriskt Bakteriell invasion av tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatiskt förbättras med hjälp av en vertikal modell diffusionskammare

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Fastställande av tolerabla fettsyror och kolera Koncentrationer Toxin Använda Human tarmepitelceller och BALB / c Macrophages Mouse

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescensanalys av stresskristallbildning efter bakteriell utmaning av däggdjursceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...