Name: identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

نود أن نشكر ديفيد رودريغيز، MA لتصميم الرسوم البيانية والتصوير في هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من GCCRI، المعاهد الوطنية للصحة / NIA (5R21AG033339) ودعم مركز السرطان غرانت (P30CA054174) إلى مرفق UTHSCSA التدفق الخلوي الأساسية ومرفق UTHSCSA المتقدم الأحماض النووية الأساسية.

الكريات البيض من اسي الفئران المعدلة وراثيا على C57BL / 6 خلفية لا تعبر عن هيئة السلع التموينية-1 (الشكل 1). لذلك، إذا هيئة السلع التموينية-1 هو علامة تستخدم لتنقية الخلايا، تحتاج إلى أن عبرت مع السلالة المناسبة لاكتساب هيئة السلع التموينية-1 التعبير هذه الفئ?...

ويستند في الجسم الحي الطفرات مقايسة الموصوفة هنا على اسي نموذج الفأر وراثيا ولدت في الأصل من قبل كولر وآخرون 18 وهذا النموذج يستخدم ناقلات λ فج يحمل الجين مراسل اسي. اثنين كوس مواقع المرافقة ناقلات تسمح للانتعاش بسيط نسبيا والتعبئة والت?...

<html> في معظم أنسجة وخلايا متباينة لديها محدودة مدى الحياة. للحفاظ على سلامة وظيفية، والخلايا الجذعية الأنسجة محددة الأجل الطويل تنتج باستمرار الخلايا الاصلية التي تعطي بدورها إلى ظهور خلايا متباينة تماما المطلوب للوظيفة أن الأنسجة معينة. الخلايا الجذعية أيضا تجديد المقصورة الخاصة بهم من خلال عملية تسمى التجديد الذاتي. وبالتالي، والخلايا الجذعية هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة وظيفية من الأنسجة التي يقيمون فيها ولذلك، لا بد من أن أنها مجهزة آليات قوية لاستشعار ويحتمل أن إصلاح تلف الحمض النووي. إذا لم يكن كذلك، قد يكتسب متعددة الجيني (يمكن أن تكون ضارة) الاضطرابات، والتي يمكن أن تكون موروثة من قبل ذريتها. فهم كيفية الخلايا الجذعية آمن حراسة الجينوم أثناء العمر الافتراضي للكائن الحي هو السؤال المهم، وربما تساعدنا على فهم لماذا يرتبط عدم الاستقرار الجيني مع السرطان وبعض الأمراض المرتبطة بالعمر أخرى (إعادة النظر في 1،2). الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; السيطرة على سلامة الجينوم من الأنسجة على مستوى الخلايا الجذعية أو السكان الخلية السلف في وقت مبكر يمكن أن يتحقق إما عن طريق القضاء على عيب الجذعية (أو السلف) الخلايا عبر موت الخلية، الشيخوخة أو التمايز، و / أو عن طريق إصلاح كفاءة الحمض النووي للتلف. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أنه من الممكن لقياس أنواع معينة من إصلاح الحمض النووي مباشرة في هؤلاء السكان نادرة 3-6. تم العثور على أنه، على سبيل المثال في نظام المكونة للدم، فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة يمكن إصلاحه من قبل إعادة التركيب مثلي (HR) أو نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ)، ويجري هذا الأخير عملية إصلاح الدنيا الإخلاص، وبالتالي زيادة خطر اتخاذ أخطاء. وتستخدم في كل من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) 4،5، ولكن في الفئران يبدو أنها في الغالب NHEJ في HSCs في حين أن الخلايا الأسلاف في وقت مبكر الاستفادة من الموارد البشرية 4. وقدم ملاحظة مماثلة للخلايا الجذعية في الجلد 6. ومن المثير للاهتمام، في الإنسان HSCs الموارد البشرية، لا NHEJ،ويبدو أن آلية إصلاح خيار لفواصل حبلا مزدوجة 3. إذا كان هذا الفرق الوظيفي بين النوعين هو حقيقي أو يمثل الفرق تكنولوجية أو مجرد التجريبية يبقى أن نرى. مرجع خلية الجذعية لإصلاح تلف الحمض النووي من المرجح أن تشمل آليات إصلاح الحمض النووي الأخرى، مثل إصلاح قاعدة الختان (ديسمبر)، النوكليوتيدات إصلاح الختان (NER) وإصلاح عدم تطابق (MMR). البر وNER هي المسؤولة عن إصلاح الآفات الزوج قاعدة واحدة أو متعددة في الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل، في حين عدم التطابق إصلاحات MMR قاعدة قاعدة والحلقات الإدراج / حذف؛ هذه الأنواع من الحمض النووي من التلف لا يمكن إصلاحه من قبل NHEJ أو الموارد البشرية. دعم هذه الفكرة العديد من الدراسات من نظام المكونة للدم مما يدل على وجود صلة بين التعديلات في واحدة من هذه الممرات وتشوهات في المقصورة HSC 7-9، فضلا عن زيادة خطر تطور متلازمة خلل التنسج النقوي 10-16، وهو المرض الذي ينشأ فيويرتبط شهادة الثانوية العامة وذلك مع زيادة عدم الاستقرار الجيني كما تقدم المرض 17. اعتبارا من بعد، لم يتم الإبلاغ عن قياسات البر، نير وMMR مباشرة في HSCs. بالإضافة إلى توضيح العمليات المختلفة التي تتحكم في سلامة الأنسجة على مستوى الآلية، لا بد أن تكون قادرة على قياس مدى تحور الحمض النووي، بحيث يمكن اختبار عواقب الانحرافات في واحدة من هذه العمليات، على سبيل المثال في الحالات العادية مقابل راثيا الخلايا الجذعية هندسيا أو القديمة مقابل الشباب. ومع ذلك، وضع مقايسة ذات الصلة من الصعب بسبب ندرة الخلايا الجذعية الأنسجة محددة وعدم وجود ظروف الثقافة التي تحافظ على &quot;stemness&quot;. علاوة على ذلك، ينبغي أن يكون مثل هذا الفحص قابلة للتعديل إلى التلاعب البيئية والوراثية. أحد الحلول الممكنة لهذه القيود والمتطلبات هو استخدام نماذج الماوس التي صممت خصيصا للكشف عن الطفرات الحمض النووي. مولوقد وضعت نماذج الماوس المعدلة وراثيا tiple للكشف عن الطفرات. على سبيل المثال، اسي الفئران المعدلة وراثيا 18 تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي الجين يشفر اسي القامع للمشغل لاك وبمثابة مراسل الطفرة. على تحور الجين اسي، يتم تنشيط المشغل لاك ويتم إنتاج β-غالاكتوزيداز. يشق β-غالاكتوزيداز ومولد اللون الركيزة X-غال (5-برومو-4-كلورو الإلكترونية indolyl-β-D-galactopyranoside)، الذي يحوله الأزرق. مواقع كوس المرافقة ناقلات اسي يسمح الانتعاش سهلة من خلال امدا البروتينات فج والعدوى اللاحقة من E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة X-غال، يمكن وسجل لويحات. ويحات زرقاء تحتوي على متحولة المفترضة لاك-I تحمل فج، في حين لويحات واضحة تؤوي غير المسوخ. تردد لويحات زرقاء (من بين اله منها واضح) يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. وعلاوة على ذلك، فإن فج λ استضافة هدف اسي يمكن أن تكون متسلسلة بسهولة باستخدام تقنيات PCR للتحليل إنتاجية عالية نسبيا. وسوف تتابع متعددة الجينات الطافرة اسي تكشف عن معلومات مهمة حول الطيف الطفرة، والتي بدورها قد تشير إلى أوجه القصور المحتملة في مسارات محددة إصلاح الحمض النووي أو الأحداث سمية جينية محددة. تم توحيد نظام المعدلة وراثيا اسي عبر مختبرات متعددة 19 وتتوفر الكواشف تجاريا. واحد العيب الرئيسي لنظام اسي هي قدرة محدودة للكشف عن عمليات الحذف كبيرة أو إعادة ترتيب، وبالتالي، وأساليب أخرى، على سبيل المثال متعددة الألوان FISH على هوامش الطورية حاجة لاستخدامها لتكمل هذا النقص. داخل ناقلات λ فج من طراز اسي الماوس، هناك الجين أصغر بكثير، CII، وهي متاحة للتحليل الطفرة. حجمها، وحقيقة أن المسوخ يمكن اختيار يجعل هذا أقل كثيفة العمالة وأرخص مقايسة 20 من تحليل الجينات اسي. ومع ذلك، يتم دراسة هذا الجين اسي أكثر على نطاق واسع ل21 الطفرات وحساسية الجينات إلى حدوث طفرات اتسم جيدا حتى لا يكون هناك فهم واضح من مخلفات الأحماض الأمينية التي تولد استجابة المظهري على ركيزة مولد اللون 22-25. وتشمل نماذج الماوس الأخرى للكشف عن طفرة استخدام ΦX174 أو الجينات المحورة LacZ. نموذج الفأر وراثيا ΦX174، مع A الأصلي: T → G: C طفرة الارتداد مقايسة 26 أو الطفرة مقايسة 27 قدما التي تسمح الكشف عن مجموعة متنوعة من بدائل الزوج القاعدة، يمثل النظام أقل تكلفة من طراز اسي. ومع ذلك، فإن شاشة طفرية في مقايسة إلى الأمام ليست تافهة والمواصفات الطفرةليس كما يتميز جيدا trum من التحوير ΦX174 كما ان من اسي. في نماذج الماوس تحمل الجينات المحورة LacZ، يتم استرداد مراسل طفرية LacZ الاستفادة E. الخلايا المضيفة القولونية التي تعتبر حساسة لالجالاكتوز والمتوسطة التي تحتوي على اللبن 28. ومن عيوب هذا النظام هو أن انتعاش الهدف LacZ ينطوي أيضا على تقييد نوكلياز داخلية الهضم تليها ربط و electroporation من E. تستضيف القولونية، مما يجعل من الصعب على التكيف مع النظام لأعداد صغيرة من الخلايا. على الرغم من أنه ليس شرطا مطلقا للعمل مع السكان الخلايا الجذعية / السلف (واحد يمكن أن تبدأ دائما مع مزيد من الفئران)، إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من الخلايا (مثل الملايين أو أكثر) وسوف يصبح غير عملي بسرعة وباهظة التكلفة. أيضا، حجم كبير نسبيا من LacZ، مع توفير مراسل طفرية حساسة، هي مرهقة ومكلفة أكثر للتحليل تسلسل الحمض النووي وdetermination من طفرة الأطياف. والميزة الرئيسية لهذا النموذج ومع ذلك، هو قدرتها على الكشف عن الحذف والإدراج كبيرة، فضلا عن إعادة ترتيب الكروموسومات. حيث أن جميع الخلايا في نماذج الماوس المعدلة وراثيا اسي، ΦX174 وLacZ تحمل نظام المراسل، أي من هذه النماذج الماوس يمكن استخدامها لقياس الطفرات في أي نوع من الخلايا في المصالح، بما في ذلك الخلايا الجذعية والسلف، طالما أنها يمكن أن تحصد موثوق وبأعداد كافية. لأن كان لدينا خبرة واسعة مع نموذج الفأر اسي واسي فحص الطفرة، قررنا متابعة هذا النظام لتحليل مزيد من الطفرات في الجذعية المكونة للدم والسكان السلف. الأنسجة المكونة للدم يتميز جيدا من حيث النمط الظاهري سطح الخلية مكوناته الفردية، بما في ذلك إعادة إسكانها الخلايا الجذعية طويلة الأجل، والتي يمكن تحديدها على النحو السكان نادرة للغاية من لين - IL7R <suع&gt; - هيئة السلع التموينية-1 + + + cKit (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - الخلايا 29. . Mohrin 4 آخرون أظهرت أن عدد السكان أكبر قليلا من LSK/Flk2 - خلايا لا تزال جيدة لممثلي HSCs وتختلف اختلافا كبيرا من الأكثر بدائية السلف النخاعي ملتزمة (CMP) السكان عندما يتعلق الأمر بدراسة إصلاح الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، عندما LSK HSC المخصب (FLK-2 + وFLK-2 -) وتمت مقارنة الخلايا إلى لين - IL7R - هيئة السلع التموينية-1-cKit + + (الخلايا الاصلية LS-K)، وكان لا يزال هناك اختلاف كبير في NHEJ قدرة 5 بين أقل نقية، وقف التخصيب خلية السكان LSK والخلايا الاصلية. في دراستنا نستخدم HSC التخصيب LSK (FLK-2 + وFLK-2 -) خلايا لأننا وجدنا أن لا يقل عن 2 × 10 5 خلايا مطلوبة ل، نتائج متسقة يمكن الاعتماد عليها في هذا الطفرات فحص، وهذا هو عدد الخلايا في غاية الصعوبةللحصول على واحدة عند فرز LSK/Flk2 - السكان CD150 + CD48 أو حتى LSK/Flk2 - السكان (من حيث الفئران والتكاليف والتطبيق العملي). هذا البروتوكول، على أساس واحد ضعت أصلا من قبل كولر وآخرون 18 يصف بالتفصيل كيف يمكن تحديد عفوية تردد متحولة الحمض النووي في الخلايا LSK والسكان من خلايا الدم النخاعي متباينة وكذلك خلايا نخاع العظم والطحال unseparated محددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

في السنوات الأخيرة، أصبح واضحا أن عدم الاستقرار الجيني يرتبط بإحكام لكثير من اضطرابات النمو، والسرطانات، والشيخوخة. نظرا إلى أن الخلايا الجذعية هي المسؤولة عن ضمان التوازن وإصلاح الأنسجة في جميع مراحل الحياة، فمن المعقول أن نفترض أن السكان الخلايا الجذعية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة الجينوم من الأنسجة. لذا، قد نشأ اهتمام كبير في تقييم تأثير العوامل الذاتية والبيئية على سلامة الجينوم في الخلايا الجذعية وذريتها، التي تهدف إلى فهم مسببات أمراض الخلايا الجذعية القائمة. اسي الفئران المعدلة وراثيا تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي يخدم هذا الجين كما اسي مراسل الطفرة. نتيجة لاسي الجين المتحور هو إنتاج β-غالاكتوزيداز أن يشق ركيزة مولد اللون، ويحولها الأزرق. نظام مراسل اسي هو أنني نفذتن جميع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية / السلف ويمكن بسهولة أن تعافى واستخدامها لاحقا تصيب E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة الصحيحة، يمكن لويحات وسجل؛ ويحات زرقاء تشير إلى وجود اسي الجين الطافر، في حين لويحات واضحة تؤوي من النوع البري. تواتر الأزرق (بين واضح) لويحات يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. سوف تسلسل الجين الطافر اسي تظهر في موقع من الطفرات في جين ونوع من الطفرات. وراسخة في نموذج الفأر وراثيا اسي باعتبارها في الجسم الحي الطفرات الفحص. وعلاوة على ذلك، تتوفر تجاريا الفئران والكواشف لفحص. نحن هنا تصف بالتفصيل كيف يمكن تكييف هذا النموذج لقياس التردد التي تحدث بشكل عفوي المسوخ الحمض النووي في الخلايا الجذعية التخصيب لين - IL7R - هيئة السلع التموينية-1 + + + cKit (LSK) الخلايا والمجموعات السكانية الفرعية الأخرى التابعة لمنظومة المكونة للدم.

<html> في الجسم الحي الطفرات فحص يقيس حدث نادر (PFUs متحولة) من بين العديد من الأحداث (كل PFUs). عن طريق إجراء فحص مع عدد صغير من الخلايا، فمن الممكن أن حصيلة يتأثر إلى حد كبير من خلال النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة. لمعالجة هذه المسألة أجرينا تجربة التخفيف ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins.

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Population Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

الحصول على عالي النقاء المقوسة الغوندية البيضات من قبل التدرج كلوريد السيزيوم متقطع

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

تحديد الجينات المستحثة بواسطة Dysregulated الفيروسة ساركومة المرتبطة كابوزي (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

حقن النظامية من الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الفئران مع EAE المزمن

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...