Name: identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00
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我们要感谢大卫·R·罗德里格斯，马的平面设计和摄影在这个手稿。这项工作是由来自GCCRI，美国国立卫生研究院/国家行政学院（5R21AG033339）和癌症中心支援津贴（P30CA054174）到UTHSCSA流式细胞仪核心设施和UTHSCSA先进的核酸核心设施提供资金支持。

从LacI的转基因小鼠在C57BL / 6背景白细胞不表达的Sca-1（ 图1）。因此，如果的Sca-1是用于细胞纯化的标记物，这些小鼠中需要用合适的菌株获得的Sca-1的表达被划线，在这种协议定期的C57BL / 6（B6）小鼠和LacI上的杂交的F1 （C57BL / 6）的转基因小鼠（LacI的 ）是使用（ 图1）。在这个协议中使用的细胞群，LSKs和中医师表示最小种群骨髓。为了从唯一的后腿?...

本文中描述的体内诱变法是基于最初由Kohler 等人，18该模型利用λ噬菌体载体携带的lacI报告基因产生的LacI的转基因小鼠模型。这两个COS网站侧翼矢量允许一个相对简单的恢复和后续包装成感染性噬菌体颗粒，用来感染大肠杆菌大肠杆菌 。一个蓝色的牌匾将被噬菌体感染的大肠杆菌产生含有突变基因LacI的大肠杆菌 。蓝色的牌匾是对一?...

在大多数组织中，分化的细胞具有有限的寿命。为了保持功能完整，长寿命，组织特异性干细胞不断产生祖细胞，这反过来会产生所需的特定的组织的功能的完全分化的细胞。干细胞还可以通过一个叫做自我更新过程中补充自己的车厢。因此，干细胞是负责维护他们居住。因此组织的功能完整，是非常重要的，他们都配备了强大的机制来检测和潜在的修复受损的DNA。如果没有，他们可能获得多个基因（可能有害）的扰动，可以通过他们的后代继承。了解在一个生物体的寿命怎么干细胞的安全，保卫自己的基因组是一个重要的问题，可以帮助我们理解为什么基因组不稳定性与癌症和其他一些与年龄有关的疾病（在1,2审查）相连。 3-6测量某些类型的DNA修复。我们发现，例如，在造血系统中，双链DNA的断裂，可通过同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ），后者是较低保真度的修复过程，从而使增加的风险修错误。两者都被利用在造血干细胞（HSCs）4,5，然而，在小鼠中，似乎它主要是NHEJ在造血干细胞，而早期祖细胞利用HR 4。类似的观察是为干细胞在皮肤6。有趣的是，在人类造血干细胞的人力资源，而不是NHEJ，似乎是首选的双链断裂3的修复机制。无论这两个物种之间的功能差异是真实的还是仅仅代表一个技术或实验的差异，还有待观察。 干细胞的剧目，以修复受损的DNA很可能包括其它DNA修复机制，如碱基切除修复（BER），核苷酸切除修复（NER）和错配修复（MMR）。 BER和NER负责修理单个或多个碱基对病变的单链DNA，而MMR修复碱基 - 碱基错配和插入/缺失环;这些类型的DNA损伤不能被NHEJ或HR修复。支持这一概念是从造血系统证明在这些途径和异常在HSC室7-9中的一个变化之间的联系，以及显影骨髓增生异常综合征10-16，一种疾病，起源于风险增加若干研究HSC和与增加基因组不稳定性随着病情的发展17有关。到目前为止，还没有报道的误码率，净入学率，和MMR直接在造血干细胞的测量。 除了 ​​阐明了在一个机械控制电平组织完整性的各种处理，就必须能够测量突变的DNA的程度，从而使像差在这些过程中的一个后果可以进行测试， 例如 ，在正常与基因改造的干细胞或老与年轻。然而，有关测定的发展是因为组织特异性干细胞的缺乏及缺乏的培养条件，可以保留“干细胞”的困难。此外，这样的测定应易于进行环境和遗传操作。一种可能的解决方案，这些限制和要求是采用了专门设计的，以检测DNA突变的小鼠模型。 MUL已经开发tiple转基因小鼠模型进行突变检测。例如，LacI的转基因小鼠18携带一个可恢复的λ噬菌体载体编码了LacI报道系统，其中的了LacI基因编码Lac操纵的抑制剂和作为突变记者。待了LacI基因的突变，lac 操纵子被激活，并且β-半乳糖苷酶的生产。 β-半乳糖苷酶裂解产色底物X-gal的（5 - 溴-4 - 氯-E-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷），它把它的蓝色。该COS的网站侧翼LacI的载体可以轻松地恢复由λ噬菌体的蛋白质和E的后续感染大肠杆菌 。培养大肠杆菌感染后， 大肠杆菌琼脂糖含有X-gal的基板，斑块可以拿下。蓝色斑块含有一个假定的突变紫胶，我携带的噬菌体，而清晰的斑块怀有非突变体。蓝斑的频率（在日ë明确的）指示在原始细胞群的DNA从提取出的突变频率。此外，λ噬菌体托管LacI的目标可以很容易地利用PCR技术进行相对高通量测序分析。测序多个突变了LacI基因将揭示关于突变谱，这反过来又可以指向特定的DNA修复途径可能存在的缺陷，或以特定的基因毒性事件的重要信息。在LacI的转基因系统已经被标准化到多个实验室19和试剂是市售的。在LacI的系统的一个主要缺点是，检测大的缺失或重排的能力有限，因此，其他的方法， 例如 ，多色FISH对中期扩展需要被用来赞美这方面的不足。 内的LacI的小鼠模型中的λ噬菌体载体，有一个更小的基因，CII，可用于突变分析。它的大小和事实，即突变体可以选择使这比LacI的基因分析少，劳动密集和更便宜的检测20。然而，LacI的基因被更广泛地研究用于诱变21和基因突变的敏感性已被很好地表征，以便有氨基酸残基生成的显色底物22-25表型应答的清楚的理解。 其他小鼠模型进行突变检测包括使用ΦX174或LacZ基因的转基因。该ΦX174转基因小鼠模型，与原A：T→G的：C回复突变试验26或正向突变试验27，使检测碱基对替换的频谱的，代表一个成本更低的系统比LacI的模型。然而，在正向测定法的突变屏幕是不平凡的，该突变规格该ΦX174转基因的TRUM不作为良好的特点为，该LacI上的。在进行LacZ的转基因小鼠模型中，LacZ基因突变记者被回收利用E。大肠杆菌宿主细胞，以半乳糖和半乳糖含有28培养基敏感。这个系统的一个缺点是，LacZ基因靶的恢复也涉及到限制性内切酶消化后，通过连接大肠杆菌的和电穿孔大肠杆菌宿主，由此使得难以适应系统以小数量的细胞。虽然它不是用于干/祖细胞群的工作是绝对需要的（一个可以随时开始更加小鼠），如果需要大量的细胞（ 例如百万或更多）也将很快成为不切实际，成本太高。此外，LacZ基因的体积比较大，同时提供一个敏感的突变记者，繁琐，更昂贵的DNA序列分析和determ的萌发的突变谱。这种模式的主要优点但是，它能够检测到大缺失和插入，以及染色体重排。 由于所有细胞在LacI上，ΦX174和LacZ转基因小鼠模型进行的报告系统，所有这些小鼠模型可用于测量诱变在任何感兴趣的细胞类型，包括干细胞和祖细胞，只要它们能够可靠地收集以及足够数量的。因为我们与LacI的小鼠模型和LacI的突变分析的丰富经验，我们决定对本系统进一步诱变分析造血干细胞和祖人口。 造血组织是良好的特点在它的各个组成部分，包括长期再植干细胞，这是识别成霖的极为罕见人口的细胞表面表型方面- IL7R <suP&gt; -的Sca-1 + CKIT + +（LSK）/ FLK2 - CD150 + CD48 -细胞29。 。Mohrin等[4]表明，LSK/Flk2的稍大人口-细胞仍是良好的造血干细胞代表和显著的不同从最原始的承诺髓系祖（CMP）的人口，当涉及到研究DNA修复。此外，当HSC-富集LSK（的Flk-2 +和的Flk-2 - ）细胞相比，林- IL7R -的Sca-1-CKIT + +（LS-K祖细胞），但仍然是在一个显著差异NHEJ低纯度的能力5，干细胞富集的LSK人口和祖细胞。在我们的研究中，我们使用的HSC富集的LSK（的Flk-2 +和的Flk-2 - ）细胞，因为我们发现至少有2×10 5细胞都需要一致的，可靠的结果，在这个突变检测，这细胞数目是非常困难的取得时1排序LSK/Flk2 - CD150 + CD48人口甚至LSK/Flk2 -人口（在小鼠中，成本和实用性方面）。此协议的基础上，最初由Kohler 等人开发的18一详细介绍了如何自发的DNA突变频率可以在LSK细胞决定和分化的定义髓系细胞群体以及未分离的骨髓和脾脏细胞。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

在最近几年，已经很明显，基因组不稳定性是紧密相关的许多发育障碍，癌症和衰老。由于干细胞有责任确保整个生命组织的平衡和修复，这是合理的假设，该干细胞群是维护组织的基因组的完整性至关重要。因此，显著的兴趣已经出现在评估内源性和环境因素对干细胞基因组的完整性及其后代的影响，旨在了解干细胞基础疾病的病因。 LacI的转基因小鼠携带一个可恢复的λ噬菌体载体编码了LacI报道系统，其中的了LacI基因作为突变记者。突变了LacI基因的结果是产生β-半乳糖苷酶能够水解显色底物，将它的蓝色。该LacI的报告系统是我进行n上的所有细胞，包括干细胞/祖细胞，并可以很容易地回收并用于随后感染大肠杆菌大肠杆菌 。培养大肠杆菌感染后， 大肠杆菌琼脂糖包含正确基板，斑块可以拿下;蓝斑表明突变了LacI基因，同时明确斑块怀有野生型。蓝色（其中清除）斑块的频率指示在原始细胞群的DNA从提取出的突变频率。测序突变了LacI基因将会显示突变的基因中的位置和突变的类型。 该LacI的转基因小鼠模型是行之有效的体内突变检测。此外，小鼠和试剂用于测定是市售的。在这里，我们详细描述了如何这种模式可以用来测量自发发生的DNA突变在干细胞富集的林频- IL7R -的Sca-1 + CKIT +（LSK）细胞和造血系统的其他亚群。

<html> 体内突变分析测量一个罕见的事件（突变个PFU）的许多事件中（所有个PFU）。通过用少量的细胞进行测定，这是有可能的结果是相当受假阳性和假阴性结果的影响。为解决这一问题，我们进行了连续稀释的实验与普通骨髓细胞，从三个不同的动物收获。我们测定了突变体的频率在这些动物的骨髓用1.4×10 6，7.0×10 5，3.5×10 5，1.75×10 5个细胞。结果（ 图7）显示输入?...

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Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

在纯化造血干/祖细胞识别DNA突变

这里我们描述了对小数目使用了LacI转基因小鼠模型纯化造血干细胞的体内诱变法。该LacI的基因可以分离来确定频率，位置和类型的DNA突变的自发产生或暴露于基因毒素后。

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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