Name: identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות לר &#39;דוד רודריגז, MA לעיצוב הגרפי וצילום בכתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מGCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) וסרטן מרכז התמיכה גרנט (P30CA054174) למתקן UTHSCSA cytometry זרימת הליבה ומתקן UTHSCSA מתקדם חומצות גרעין הליבה.

כדוריות דם לבנות מעכברים הטרנסגניים לאצי על רקע C57BL / 6 אינם מבטאים SCA-1 (איור 1). לכן, אם SCA-1 הוא סמן המשמש לטיהור תא, עכברים אלה צריכים להיות חצו עם זן מתאים כדי לקבל ביטוי SCA-1; בפרוטוקול זה F1 של הכלאה בין עכברי C57BL / 6 הרגילים (B6) ואצים (C57BL / 6) עכברים הטרנסגנ...

In vivo assay mutagenesis המתואר כאן מבוסס על המודל של עכברים הטרנסגניים לאצי שנוצר במקור על ידי קולר et al. 18 מודל זה מנצל וקטור הפאג λ נושא גן כתב לאצי. שני אתרי cos איגוף הווקטור לאפשר התאוששות פשוטה יחסית ואריזה שלאחר מכן לחלקיקי phage זיהומיות, נהגו ל?...

<html> ברוב הרקמות, תאים מובחנים תוחלת חיים מוגבלת. כדי לשמור על שלמות פונקציונלית, תאי גזע חיים ארוכים, רקמות ספציפיות ברציפות לייצר תאי אב שבתורו להצמיח תאים המובחנים באופן מלא הנדרשים לתפקוד של רקמה מסוימת. תאי גזע גם לחדש את התא שלהם באמצעות תהליך הנקרא התחדשות עצמית. לכן, תאי גזע אחראים לשמירה על השלמות הפונקציונלית של הרקמה שהם מתגוררים בי לכן, זוהי חובתו הם מצוידים במנגנונים חזקים כדי לחוש ואפשרות לתקן דנ&quot;א פגום. אם לא, הם עשויים לרכוש הפרעות מרובות גנומית (מזיקים), אשר ניתן בירושה לצאצאיהם. הבנה כיצד תאי גזע בטוחים לשמור על הגנום שלהם במהלך תוחלת החיים של האורגניזם היא שאלה חשובה ועשויה לסייע לנו להבין מדוע חוסר יציבות גנומית מקושרת עם סרטן ומחלות אחרות הקשורות לגיל (הנסקרת ב 1,2). ass = &quot;jove_content&quot;&gt; שליטה שלמות גנטית של רקמות ברמה של תאי גזע או אוכלוסיות תאים ובתאים מוקדם יכול להיות מושגת על ידי ביטול או גזע פגום (או אב) תאים באמצעות מוות של תאים, הזדקנות או בידול, ו / או על ידי תיקון יעיל ה-DNA של ניזוק. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ניתן למדוד סוגים מסוימים של תיקון דנ&quot;א ישירות באוכלוסיות נדירות אלה 3-6. נמצא כי, למשל במערכת הדם, ניתן לתיקון הפסקות הדנ&quot;א כפול גדיל ידי רקומבינציה הומולוגית (HR) או שאינו הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ), האחרון להיות תהליך תיקון של נאמנות נמוכה יותר ובכך הסיכון מוגבר לביצוע שגיאות. שניהם מנוצלים בתאי גזע hematopoietic (HSCs) 4,5, לעומת זאת, בעכברים שזה נראה זה בעיקר NHEJ בHSCs ואילו תאי אבות מוקדם לנצל משאבי אנוש 4. תצפית דומה נעשתה לתאי גזע בעור 6. מעניין לציין, כי בבני HSCs משאבי אנוש, לא NHEJ,נראה שמנגנון התיקון של בחירה עבור הפסקות גדיל כפולות 3. אם הבדל פונקציונלי בין שני המינים הוא אמיתי או רק מייצג את הבדל טכנולוגי או ניסיוני נותר לראות. הרפרטואר של תאי גזע כדי לתקן דנ&quot;א פגום צפוי לכלול מנגנוני תיקון DNA אחרים, כגון תיקון כריתת בסיס (BER), תיקון כריתת נוקלאוטיד (נר) ותיקון אי התאמה (MMR). BER והנר אחראים לתיקון נגעי זוג בסיס יחיד או מרובים ב-DNA חד גדילים, ואילו חוסר התאמה תיקוני MMR בסיס בסיס ולולאות הכנסה / מחיקה, אלו סוגים של נזק לדנ&quot;א לא ניתן לתיקון על ידי NHEJ או משאבי אנוש. תמיכה ברעיון זה כמה מחקרים ממערכת hematopoietic הוכחת קשר בין שינויים באחד מהמסלולים האלה וליקויים בתא HSC 7-9, כמו גם סיכון מוגבר לפתח תסמונת myelodysplastic 10-16, מחלה שמקורה בHSC וכי הוא קשור עם עלייה בחוסר יציבות גנומית ככל שהמחלה מתקדמת 17. כמו של עוד, מדידות של BER, נר, וMMR ישירות בHSCs לא דווחו. בנוסף להבהרת התהליכים השונים השולטים בשלמות רקמות ברמה המכניסטית, זה הכרחי כדי שתוכל למדוד את המידה של ה-DNA שעבר מוטציה, כך שההשלכות של סטיות באחד מהתהליכים אלה ניתן לבדוק, למשל ברגילים לעומת גנטי תאי גזע מהונדסים או בישן מול צעיר. עם זאת, הפיתוח של assay רלוונטי הוא קשה בגלל המחסור בתאי גזע רקמות ספציפיות וחוסר תנאי תרבות המשמר את &quot;stemness&quot;. יתר על כן, assay כזה צריך להיות amendable למניפולציות סביבתיות וגנטיות. פתרון אפשרי למגבלות ולדרישות הללו הוא השימוש במודלים של עכברים שהונדסו במיוחד כדי לזהות מוטציות בדנ&quot;א. מולמודלים עכבר מהונדסים טייפל לזיהוי מוטציה פותחו. לדוגמא, עכברים הטרנסגניים לאצי 18 לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת כתב לאצי, שבו גן מקודד לאצי מדכא של המפעיל לאק ומשמש ככתב המוטציה. עם המוטציה של הגן לאצי, מפעיל Lac מופעל וβ-galactosidase מיוצר. דבק β-galactosidase X-gal chromogenic המצע (5-bromo-4-כלורו-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), שהופך אותו כחול. Cos אתרי איגוף וקטור האצים מאפשר התאוששות קלה על ידי חלבוני הפאג מבדה והזיהום הבא של א &#39; coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את מצע X-gal, יכול להיות הבקיע הפלאק. שלטים כחולים מכילים מוטציה המשוערת לאק, אני נושא הפאג, ואילו הפלאק ברור נמל שאינם מוטציות. התדר של שלטים כחולים (בין הדואר ברור אלה) מציין את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA שמופקת. יתר על כן, הפאג λ אירוח יעד האצים יכול להיות רצף בקלות באמצעות טכניקות PCR לניתוח תפוקה גבוהה יחסית. רצף הגנים של אצי מוטציה מרובים יחשוף מידע חשוב על ספקטרום המוטציה, אשר בתורו עשוי להצביע על ליקויים אפשריים במסלולי תיקון DNA ספציפיים או לאירועי genotoxic ספציפיים. המערכת המהונדס האצים כבר טופל בכל מעבדות מרובות 19 והחומרים הכימיים זמינים באופן מסחרי. חסרון עיקרי אחד של המערכת לאצי הוא היכולת המוגבלת לגילוי מחיקות או שחלופים גדולים, ולכן, בשיטות אחרות, כגון דגי צבע רב על מרווחי metaphase צריכים לשמש כדי להחמיא מחסור זה. בתוך וקטור הפאג λ של מודל עכבר לאצי, יש גן קטן בהרבה, כת&quot;ש, זמין עבור ניתוח מוטציה. הגודל שלה והעובדה שניתן לבחור מוטציות שעושים את זה assay עתיר עבודה וזולה פחות 20 מהניתוח הגנטי לאצי. עם זאת, את הגן לאצי הוא למד באופן נרחב יותר לmutagenesis 21 והרגישות של הגן למוטציות כבר מאופיין היטב, כך שיש הבנה ברורה של שאריות חומצת אמינו שיוצרות תגובת פנוטיפי על מצע chromogenic 22-25. דגמי עכבר אחרים לזיהוי מוטציה לכלול את השימוש של ΦX174 או transgenes LacZ. מודל ΦX174 המהונדס העכבר, עם המקורי: T → G: מוטציה חזרה C assay 26 או assay המוטציה קדימה 27 המאפשר זיהוי של ספקטרום של החלפות זוג בסיס, מייצג מערכת פחות יקרה מאשר המודל לאצי. עם זאת, מסך מוטאציות בassay קדימה אינו טריוויאלי ומפרט המוטציהמוסטרום של transgene ΦX174 לא כמאופיין היטב כמו זה של לאצי. במודלים של עכברים שנשאו transgenes LacZ, כתב מוטאציות LacZ הוא התאושש ניצול E. תאי מארח coli שרגישים לגלקטוז ובינוני המכיל גלקטוז 28. חסרון של שיטה זו הוא שהתאוששות של יעד LacZ כרוך גם עיכול endonuclease הגבלה ואחרי קשירה וelectroporation של א &#39; coli מארח, ובכך הופך אותו קשה להתאים את המערכת למספר קטן של תאים. למרות זאת הוא לא דרישה מוחלטת לעבודה עם אוכלוסיות תאי גזע / אב (תמיד אפשר להתחיל עם יותר עכברים), אם מספר גדול של תאים נדרשים (לדוגמא במיליונים או יותר) זה יהיה לא מעשי ועלות אוסרני במהירות. כמו כן, הגודל גדול יחסית של LacZ, תוך מתן כתב מוטאציות רגיש, הוא מסורבל ויקר יותר לניתוח רצף ה-DNA וdetermination של ספקטרום מוטציה. יתרון עיקרי של מודל זה לעומת זאת, הוא יכולתה לזהות מחיקות והוספות גדולות, כמו גם שחלופים בכרומוזומים. מכיוון שכל התאים במודלי העכבר מהונדסים לאצי, ΦX174 וLacZ לשאת את המערכת העיתונאית, כל אחד ממודלים של עכברים אלה יכול לשמש למדידת mutagenesis בכל סוג תא של עניין, כולל בתאי גזע ואב, כל עוד הם יכולים להיות שנקטפו באופן מהימן ובכמות מספקת. כי היו לנו ניסיון רב עם מודל עכבר לאצי וassay המוטציה לאצי, החלטנו להמשיך את המערכת הזו עוד יותר לניתוח mutagenesis בגזע hematopoietic ואוכלוסיות אב. רקמות hematopoietic היא מאופיינות היטב במונחים של הפנוטיפ של הרכיבים הבודדים שלה, כוללים בתאי גזע repopulating לטווח ארוך, אשר ניתנים לזיהוי כאוכלוסייה נדירה ביותר של לין פני תא - IL7R <sup&gt; - SCA-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - תאי 29. . Mohrin אח&#39; 4 הראו כי האוכלוסייה הגדולה במעט של LSK/Flk2 - תאים הם עדיין נציגים טובים לHSCs ושונה באופן משמעותי מהאב מיאלואידית מחויב הפרימיטיבי ביותר אוכלוסייה (CMP) כשזה מגיע ללימוד תיקון DNA. יתר על כן, כאשר LSK המועשר-HSC (flk-2 + וflk-2 -) תאים הושוו ללין - IL7R - SCA-1-cKit + + (תאי אב LS-K), יש עדיין היה הבדל משמעותי ב יכולת NHEJ 5 בין פחות טהור, גזע אוכלוסיית LSK המועשר בתאים ותאי האב. במחקר שלנו אנו משתמשים HSC מועשר LSK (flk-2 + וflk-2 -) תאים כי מצאנו כי לפחות 2 x 10 5 תאים נדרשים לתוצאות עקביות, אמינות בassay mutagenesis זה; מספר תא זה קשה מאודלהשיג כאשר אחד ממיין את LSK/Flk2 - אוכלוסיית CD150 + CD48 או אפילו LSK/Flk2 - האוכלוסייה (במונחים של עכברים, עלויות ומעשיות). פרוטוקול זה, המבוסס על אחד שפותח במקור על ידי קולר et al. 18 מתאר בפירוט כיצד תדירות המוטציה הספונטנית DNA ניתן לקבוע בתאי LSK והוגדרה אוכלוסיות של תאי מיאלואידית מובחנים, כמו גם תאי מח עצם unseparated וטחול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור כי חוסר יציבות גנומית קשור בחוזקה רבות הפרעות התפתחותיות, סרטן והזדקנות. בהתחשב בעובדה שתאי גזע אחראים להבטיח הומאוסטזיס רקמות ותיקון לאורך כל חיים, סביר לשער שהאוכלוסייה בתאי גזע הוא קריטית לשמירה על שלמות גנטית של רקמות. לכן, עניין משמעותי שקם בהערכת ההשפעה של גורמים במשק וסביבתי על שלמות הגנום בתאי גזע וצאצאיהם, במטרה להבין את האטיולוגיה של מחלות בתאי גזע מבוססות. עכברים הטרנסגניים לאצי לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת הכתב לאצי, שבו הגן לאצי משמש ככתב המוטציה. התוצאה של גן שעבר מוטציה לאצי היא הייצור של β-galactosidase המסלק את מצע chromogenic, הפיכתו הכחולה. מערכת כתב האצים היא נשאתיn כל התאים, כולל תאי גזע / אב והוא יכול בקלות להיות התאושש ונהג להדביק לאחר מכן א &#39; coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את המצע הנכון, יכול להיות הבקיע הפלאק; שלטים כחולים מצביעים על גן שעבר מוטציה לאצי, ואילו הפלאק ברור נמל wild-type. התדירות של כחול (בין ברור) הפלאק מציינת את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA היה שחולצה מן. רצף הגן לאצי המוטציה יציג את מיקומם של המוטציות בגן והסוג של מוטציה. מודל העכבר המהונדס האצים הוא מבוסס היטב כin vivo assay mutagenesis. יתר על כן, העכברים וריאגנטים עבור assay זמינים מסחרי. כאן אנו מתארים בפירוט כיצד מודל זה ניתן להתאים למדוד את תדירות מוטציות DNA מתרחש באופן ספונטני בלין המועשר בתאי גזע - IL7R - SCA-1 + cKit + + (LSתאי K) ואוכלוסיות אחרות של מערכת hematopoietic.

<html> In vivo assay mutagenesis מודד אירוע נדיר (PFUs מוטציה) בין אירועים רבים (כל PFUs). על ידי ביצוע assay עם מספר קטן של תאים, זה אפשרי שהתוצאה מושפעת במידה ניכרת על ידי תוצאות חיוביות שגויות וכוזבות שליליות. כדי לטפל בבעיה זו ביצענו ניסוי דילול סדרתי עם תאי מח עצם unfractionated, שנקטפו מש?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Population Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...