Name: identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

Vi vill tacka David R. Rodriguez, MA för grafisk design och fotografi i detta manuskript. Detta arbete stöddes av medel från GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) och Cancer Center Support Grant (P30CA054174) till UTHSCSA flödescytometri Core-anläggningen och UTHSCSA Advanced nukleinsyror Core Facility.

Leukocyter från LacI transgena möss på en C57BL / 6 bakgrund uttrycker inte Sca-1 (Figur 1). Därför, om Sca-1 är en markör som används för cellrening, dessa möss måste korsas med en lämplig stam för att få Sca-1 uttryck, i detta protokoll F1 av en korsning mellan vanliga C57BL / 6 (B6) möss och LacI (C57BL / 6) transgena möss (LacI) användes (Figur 1). Av cellpopulationer som används i detta protokoll, LSKs och sådana planer utgör de minsta...

In vivo-mutagenes-analysen beskriven häri baseras på Lacl transgen musmodell ursprungligen genererad av Kohler et al. 18 Denna modell använder en λ fagvektor som bär en lacl-reportergen. De två cos-ställen som flankerar vektorn möjliggör en relativt enkel återvinning och efterföljande förpackning i infektiösa fagpartiklar, användes för att infektera E. coli. En blå plack kommer att genereras av fag-infekterad E. coli som innehålle...

I de flesta vävnader, differentierade celler har en begränsad livslängd. För att bibehålla funktionell integritet, långlivade, vävnadsspecifika stamceller producerar kontinuerligt stamceller som i sin tur ger upphov till helt differentierade celler som krävs för funktionen av just den vävnad. Stamceller fylla även den egna fack genom en process som kallas självförnyelse. Sålunda stamceller är ansvariga för att upprätthålla den funktionella integriteten hos vävnaden de bor i. Därför är det absolut nödvändigt att de är utrustade med kraftfulla mekanismer för att känna av och eventuellt reparera skadad DNA. Om inte, kan de få flera iska (potentiellt skadliga) störningar, som kan ärvas av deras avkomma. Att förstå hur stamceller värna sin arvsmassa under livslängden för en organism är en viktig fråga och kan hjälpa oss att förstå varför genomisk instabilitet är kopplat till cancer och andra åldersrelaterade sjukdomar (recenserade i 1,2). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Styra genomisk integritet hos en vävnad på nivån för stamceller eller tidiga stamfadercellpopulationer kan uppnås genom att antingen eliminera defekta stammen (eller progenitor) celler genom celldöd, senescens eller differentiering, och / eller genom effektiv reparation av skadad DNA. Nya studier har visat att det är möjligt att mäta vissa typer av DNA-reparation direkt i dessa sällsynta populationer 3-6. Man har funnit att, till exempel i det hematopoietiska systemet, dubbel-sträng DNA-avbrott kan repareras genom homolog rekombination (HR) eller icke-homologa slut gå (NHEJ), den sistnämnda är en reparationsprocess av lägre trohet och därmed ökad risk för att göra fel. Båda är utnyttjas i hematopoetiska stamceller (HSCs) 4,5, men i möss verkar det främst NHEJ i HSCs medan tidiga progenitorceller utnyttjar HR 4. En liknande observation gjordes för stamceller i huden 6. Intressant i mänskliga HSCs HR, inte NHEJ,verkar vara den mekanism för val reparation av dubbelsträngsbrott 3. Huruvida detta funktionella skillnaden mellan de två arterna är verklig eller bara representerar en teknisk eller experimentell skillnad återstår att se. En stamcell repertoar för att reparera skadat DNA kommer troligen att omfatta andra mekanismer för DNA-reparation, som bas excision reparation (BER), nukleotid excision reparation (NER) och mismatch reparation (MMR). BER och NER ansvarar för reparation av enstaka eller flera baspars lesioner i enkelsträngat DNA, medan MMR fixar bas-bas-felparningar och insättning / borttagning loopar; dessa typer av DNA-skador kan inte repareras genom NHEJ eller HR. Stöd detta begrepp finns flera studier från det hematopoetiska systemet visar ett samband mellan förändringar i en av dessa vägar och avvikelser i HSC facket 7-9, samt en ökad risk att utveckla myelodysplastiskt syndrom 10-16, en sjukdom som har sitt ursprung iHSC och som har samband med ökad genomisk instabilitet som sjukdomen fortskrider 17. Än så länge har mätningar av BER, NER, och MMR direkt i HSCs inte rapporterats. Förutom att belysa de olika processer som styr vävnadsintegritet vid en mekanistisk nivå, är det viktigt att kunna mäta omfattningen av muterat DNA, så att konsekvenserna av avvikelser i en av dessa processer kan testas, till exempel i normala kontra genetiskt iscensatte stamceller eller i gamla kontra unga. Det är emellertid svårt att utveckla en relevant analys på grund av bristen på vävnadsspecifika stamceller och avsaknaden av odlingsbetingelser som bevarar &quot;stemness&quot;. Dessutom bör en sådan analys vara möjligt att ändra till miljömässiga och genetiska manipulationer. En möjlig lösning på dessa begränsningar och krav är användningen av musmodeller som är speciellt konstruerade för att detektera DNA-mutationer. Multiple transgena musmodeller för mutationsdetektion har utvecklats. Exempelvis Lacl transgena möss 18 bära en återhämtningsbar λ fagvektor kodande lacl-reportersystem, i vilket lacl-genen kodar för en suppressor av lac-operatorn och tjänar såsom mutationen reporter. Efter mutation av lacl-genen, är Lac operatören aktiverad och β-galaktosidas produceras. β-galaktosidas spjälkar det kromogena substratet X-gal (5-brom-4-klor-e-indolyl-β-D-galaktopyranosid), som visar det blå. De cos sajter flankerar Lacl vektorn medger enkel återvinning av lambda fag proteiner och efterföljande infektion av E. coli. Efter inkubation infekterade E. coli på agaros, som innehåller X-gal-substrat, kan plack görs. Blå plack innehåller en förmodad mutant Lac-Jag bär fag, medan tydliga plack hamn icke-mutanter. Frekvensen av blå plack (bland the tydliga ettor) indikerar mutantfrekvens i den ursprungliga cellpopulationen DNA extraherades från. Vidare kan λ-fag som är värd för Lacl målet lätt sekvenseras genom att använda PCR-tekniker för relativt hög genomströmning analys. Sekvense flera muterade Laci gener kommer att avslöja viktig information om mutationen spektrum, vilket i sin tur kan peka på eventuella brister i specifika DNA-reparationsvägar eller till specifika genotoxiska händelser. Den LacI transgena system har standardiserats över flera laboratorier 19 och reagenser finns i handeln. En stor nackdel med lacl-system är den begränsade förmågan att detektera stora deletioner eller omlagringar, varför andra metoder, t ex multi-color FISH på metafas-spreads behöver användas för att komplettera denna brist. Inom λ fagvektor av lacl-musmodell, finns det en mycket mindre genen CII, Tillgängliga för mutationsanalys. Dess storlek och det faktum att mutanter kan väljas gör detta till en mindre arbetskrävande och billigare analys 20 än genanalys LacI. Emellertid är lacl-genen mer omfattande studerat för mutagenes 21 och känsligheten hos den gen som mutationer har karakteriserats väl, så att det finns en tydlig förståelse av de aminosyrarester som genererar ett fenotypiskt respons på ett kromogent substrat 22-25. Andra musmodeller för mutationsdetektion innefattar användningen av X174 eller LacZ-transgener. Den X174 transgen musmodell, med den ursprungliga A: T → G: C återgång mutationsanalys 26 eller framåtmutationstest 27 som medger detektering av ett spektrum av basparsubstitutioner, utgör ett billigare system än Lacl modellen. Emellertid är inte trivialt och mutationen spec mutations skärmen i den främre assaytrum av X174 transgenen inte lika väldefinierad som den hos Lacl. I musmodeller bär LacZ transgener, är LacZ mutations reportern återvinnas utnyttja E. coli-värdceller som är känsliga för galaktos och medium innehållande galaktos 28. En nackdel med detta system är att återvinning av LacZ mål innebär också restriktionsendonukleasspjälkning följt av ligering och elektroporering av E. coli-värd, vilket gör det svårt att anpassa systemet till ett litet antal celler. Även om det inte är ett absolut krav för att arbeta med stam / progenitor-cellpopulationer (en kan alltid börja med mer möss), om ett stort antal celler erfordras (t ex miljoner eller mer) kommer det snabbt att bli opraktiskt och kostsamt. Även den relativt stora storleken på LacZ, samtidigt som en känslig mutations reporter, är besvärlig och dyrare för DNA-sekvensanalys och determnering av mutationsspektra. En stor fördel med denna modell är dock dess förmåga att upptäcka stora deletioner och insertioner, såväl som chromosomal rearrangements. Eftersom alla celler i transgena modeller lacl, X174 och LacZ mus bär reportersystem, kan någon av dessa musmodeller användas för mätning av mutagenes i vilken celltyp som helst av intresse, inklusive stam-och stamfaderceller, så länge som de säkert kan skördas och i tillräckligt antal. Eftersom vi hade lång erfarenhet med Lacl musmodell och Lacl mutationstest, beslutade vi att driva detta system vidare för mutagenes analys i hematopoetiska stam-och progenitorceller populationer. Den hematopoetisk vävnad är väl karaktäriseras i termer av cellytan fenotyp av dess enskilda delar, inklusive långsiktiga återinplantering stamceller, som kan identifieras som den extremt sällsynt population av Lin - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + ckit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - celler 29. . Mohrin m.fl. 4 visade att något större befolkning LSK/Flk2 - celler är fortfarande goda representanter för HSCs och skiljer sig mycket från den mest primitiva engagerade myeloisk progenitorceller (CMP) befolkningen när det gäller att studera DNA-reparation. Dessutom, när HSC-berikade LSK (Flk-2 + och Flk-2 -)-celler jämfört med Lin - IL7R - Sca-1-ckit + + (LS-K progenitorceller), fanns det fortfarande en betydande skillnad i NHEJ förmåga 5 mellan det mindre rena, stamcellsberikade LSK befolkningen och progenitorceller. I vår studie använder vi HSC-berikad LSK (Flk-2 + och Flk-2 -) celler eftersom vi funnit att minst 2 x 10 5 celler krävs för konsekventa, tillförlitliga resultat i denna mutagenes analys, denna cell nummer är extremt svårtatt erhålla när en sorterar LSK/Flk2 - CD150 + CD48 population eller ens LSK/Flk2 - populationen (i fråga om möss, kostnader och praktiska). Detta protokoll, som bygger på det som ursprungligen utvecklades av Kohler et al. 18 beskriver i detalj hur den spontana DNA mutantfrekvens kan bestämmas i LSK celler och definierade populationer av differentierade myeloida celler samt osorterat benmärg och mjältceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

Under senare år har det blivit uppenbart att genomisk instabilitet är tätt relaterad till många störningar i utvecklingen, cancer och åldrande. Med tanke på att stamceller ansvarar för att vävnad homeostas och reparation under hela livet, är det rimligt att antaga att stamceller befolkningen är avgörande för att bevara genomisk integritet vävnader. Därför har stort intresse uppstått för att bedöma effekterna av endogena och miljöfaktorer på genomisk integritet i stamceller och deras avkomma, i syfte att förstå etiologin av stamcellsbaserade sjukdomar. LACI-transgena möss bär en återhämtningsbar λ fagvektor kodande lacl-reportersystem, i vilket lacl-genen tjänar som mutationen reporter. Resultatet av en muterade lacl-genen är framställningen av β-galaktosidas som klyver ett kromogent substrat, vrida den blå. Den Lacl reportersystem är genom jagn alla celler, inklusive stamceller / progenitorceller och kan lätt återvinnas och användas för att därefter infektera E. coli. Efter inkubation infekterade E. coli på agaros som innehåller rätt substrat, kan plack görs, blå plack indikerar en mutant Lacl gen, medan tydliga plack hamn vildtyp. Frekvensen av blå (bland töm) plack indikerar mutantfrekvens i den ursprungliga cellpopulationen DNA extraherades från. Sekvensering av den mutanta lacl-genen kommer att visa placeringen av mutationerna i genen och typen av mutation. Den LacI transgen musmodell är väl etablerad som en in vivo-mutagenes-analys. Dessutom är de möss och reagensen för analysen är kommersiellt tillgängliga. Här beskriver vi i detalj hur denna modell kan anpassas för att mäta frekvensen av spontant förekommande DNA-mutanter i stamcellsberikade Lin - IL7R - Sca-1 + ckit + + (LSK)-celler och andra subpopulationer av det hematopoietiska systemet.

<html> In vivo-mutagenes analys mäter en sällsynt händelse (mutant PFU) bland många händelser (alla PFU). Genom att utföra analysen med litet antal celler är det möjligt att resultatet är det väsentligt påverkas av falskt positiva och falskt negativa resultat. För att behandla denna fråga som vi utförde en serieutspädningsexperiment med ofraktionerat benmärgsceller, skördas från tre olika djur. Vi mätte mutantfrekvens i benmärgen av dessa djur med användning av 1,4 x 10 6, 7,0 x 1...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifiera DNA Mutationer i renat Hematopoietic Stem / progenitorceller

Här beskriver vi en in vivo-mutagenes-analys för mindre antal renade hematopoetiska celler med Lacl transgen musmodell. Lacl-genen kan isoleras för att bestämma frekvens, plats och typ av DNA-mutanter som spontant uppstått eller efter exponering för genotoxins.

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Population Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Skaffa renat Toxoplasma gondii Oocystor av kontinuerliga cesiumklorid Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Identifiera oreglerad Gener som framkallas av Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion och Bedömning av klass Switch rekombination i Renad mus B-celler

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Kolonibildande Cell (CFC)-analys för mänskliga hematopoetiska celler

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generering av Multivirus-specifika T-celler för att förhindra / behandla virusinfektioner efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk Injektion av neurala stamceller / stamceller hos möss med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualisera protein-DNA interaktioner i levande bakteriella celler med photoactivated Single-molekyl Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...