Name: isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries
Uploaded: 2013-11-25T21:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

המחברים מודים לד&quot;ר Pooneh Bagher וד&quot;ר אריקה וסטקוט להערות עריכה בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות במספרי הפרס R37-HL041026 וR01-HL086483 לSSS וF32-HL107050 לMJS. תוכן זה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li><li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists.">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li><li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells.">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li><li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDHF:+bringing+the+concepts+together.">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li><li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-activated+K++channels+in+murine+endothelial+cells:+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium.">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li><li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2++in+arteriolar+endothelial+cells.">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li><li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries.">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li><li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels,+local+Ca2++events,+and+IKCa+channels,+reducing+arteriolar+tone.">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li><li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II:+new+insights+from+genetic+models.">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li><li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries:+role+in+vasomotor+control.">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li><li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections.">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li><li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Ca2++wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback.">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li><li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2++signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries.">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li><li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+endothelial+cell+Ca2++in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction.">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li><li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li><li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells.">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li><li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li><li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

אף אחד.

כאן אנו מתארים את הבידוד של צינורות אנדותל מהים והשימוש בתכשיר זה כדי להמחיש Ca 2 + אירועי איתות בתוך ECs המכונן שלה. הליך זה הותאם מאחד שפותח במקור לבודד צינורות אנדותל מarterioles של שריר Cremaster האוגר 8. ניצול שינויים קלים של הטכניקות שהוצגו כאן, יש לנו לבודד צינורות אנדותל ממגוון רחב של מיטות וכלי דם, כוללים: עורקי הזנה של שריר מפשק אוגר והלחי arterioles כיס 10, עורק ברום הבטן מעולה עכבר 6,7,9, mesenteric עכבר ומוחות עורקים וmicrovessels הלימפה (תצפיות לא פורסמו; אזכור כלולים לבידוד כלי mesenteric 12 וכלי מוחין 13). בידוד צינורות אנדותל מהמיטות כלי דם חדשים עשוי לדרוש שינויים בפרוטוקול המקורי. אם הבידוד הוא לא מוצלח, עדיף להתחיל על ידי שינוי פעמים עיכול:להגדיל את זמן העיכול אם צינורות אנדותל קשים לבודד מתאי שריר חלק וadventitia ולהפחית את זמן עיכול אם צינור אנדותל לא נותר על כנן. אם שינוי זמני עיכול הוא לא מוצלח, התאמת הריכוז של אנזימי עיכול או טמפרטורת העיכול צריכה להישפט. אפשרות נוספת היא להקטין את הקוטר הפנימי של פיפטה טחינה דקה, אשר מגדילה את כוח גזירה בהסרת תאי שריר חלק. הגדלת המהירות של פליטת נוזל יכול להיות גם ניסיתי במשך אותו האפקט, אבל יש יותר סיכוי לפגוע בהכנה. יש להכיר בכך שזה לא יכול להיות אפשרי לבודד צינורות אנדותל ללא פגע מכלי שבו תאי האנדותל אינם מחוברים היטב זה לזה על ידי חלבוני junctional. דיסוציאציה של תאי שריר חלק הבאים עיכול אנזימטי בתחילה בוצעה באמצעות pipettor בסגנון יד 8. יש לנו מעודן הליך טחינה דקה באמצעות microsyrמערכת אינגה, שאפשרה בידוד עקבי של צינורות אנדותל ארוכים יותר (עד 3 מ&quot;מ) 6. בעת שימוש במערכת זו, פיפטה טחינה דקה היא backfilled עם שמן מינרלים כדי לספק עמודת נוזל רציפה בין הבוכנה שליטה בתנועה וPSS המכיל את קטע כלי נוזל. Incompressibility של נוזל יחד עם כוח המניע המתמיד של תוצאות הבוכנה microsyringe בגזירה קבועה כמו הספינה נאלץ באמצעות קצה פיפטה. לעומת זאת, טכניקות ידיים המשמשות לעתים קרובות לתאים מתנערים (למשל לסחוט נורת גומי בסוף פיפטה פסטר) כרוכה בדחיסה של אוויר, אשר מציגה השתנות בלחץ הנהיגה, ובכך גזירה המופעל בקצה פיפטה. ישנם יתרונות רבים להכנת הצינור ללימוד תפקוד האנדותל בmicrovessels. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק אוכלוסיות מובחנות הומוגנית ילידים סלולריות של ECS ו mu החלקתאי scle. מאז ECs יישאר מחובר פיזי כמו צינורות, הם נבדלים מהתאים בודדים שרירים חלקים, אשר שומרים על תצורת &quot;C&quot; אם הם נשארים רגועים במהלך טחינה דקה. סוגים כך בהתאמה תא בקלות נבדלים, למשל, כאשר קבלת דגימות לשיטות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה 10. מאז צינורות מרובים מבודדים מכלי אחד (או מכלי דו צדדיים כפי שנעשה לים), ניתן לקבל נתונים מולקולריים ונתונים תפקודיים מאותו כלי של בעלי חיים מסוימים. ביטוי כך מולקולרי יכול להיות מתואם עם ההתנהגות הפונקציונלית של האנדותל כלי הדם. יתר על כן, ניתן לפתור אירועי איתות שני פנים ובין תאית מהותיים להאנדותל כלי הדם עצמאיים מהשפעתם של כוחות המודינמית (לחץ, זרימה), סוכני vasoactive נשאו בזרם הדם (למשל הורמונים), או מתאי שריר חלק שמסביב (לדוגמא60; באמצעות צימוד myoendothelial 14-16), עצבי 17, או parenchyma הרקמה 18. חשוב לציין, שכן האנדותל מבודד טרי מmicrovessels המיועד, אין שינוי של פנוטיפ שקשור בדרך אחרת עם culturing ECs 19-21. לדוגמא, ECS תרבית מאבד ביטוי הקולטן מוסקריניים ובכך לשנות את פרופילי סידן האיתות שלהם. יתר על כן, מאפייני אלקטרו של ECs יכולים לשנות בתרבות 22. בגלל ECs הבודד להישאר יחד בערוצי צומת פער פונקציונליים, צינור אנדותל מציג מודל אידיאלי לחקר ההולכה של 2 + אותות חשמליים בין התאים וCa 6,7. צריכים גם להכיר בכך שתאי שריר חלק ניתקו נלמדים בקלות עם טכניקות תיקון מהדק לנתונים משלימים שבסיס תפקוד כלי הדם 23. מגבלה העיקרית למ &#39;צינור אנדותלאודל הוא חוסר היציבות של התכשיר עם הגדלת טמפרטורה. בעוד ההכנות שלנו מהים הוכיחו יציבה ובריאים בטמפרטורת הסביבה חדר (~ 24 ° C) ובמשך כמה שעות ב32 ° C, השפלה מורפולוגיים ופונקציונלית מתרחשת בפחות משעה על 37 ° C 9. הגבלה חשובה שנייה של צינור אנדותל היא האובדן של צמתים myoendothelial ותחומים האיתות הטבועות בם, כי הם חלק בלתי נפרד מתפקוד EC בדפנות כלי הדם בשלמותה 14-16. צריך גם להכיר בכך שבעוד שצינורות ארוכים יותר יאפשר איתות אינטר להיחקר על פני מרחקים גדולים יחסית 6, הכנת הצינורות מסובכת כפי שהם מקבלים יותר, כי זה הופך להיות קשה יותר כדי לנתק באופן מלא המקיף את תאי שריר חלק וadventitia. מצאנו כי צינורות ארוכים יותר מ1-2 מ&quot;מ גם קשים יותר למצב ובטוח בתא הזרימה. בניגוד לכך, בעוד שצינורות קצרים יותר (לדוגמא: &lt;1 מ&quot;מ) ENACa 2 + וחשמל אותות ble להיחקר 8, הם קשה לשמור במהלך superfusion בתא הזרימה. לבסוף, גם עם בידוד אופטימלי של צינורות בילטרלי, יש חומר מספיק לכימות מסורתי של ביטוי חלבון באמצעות כתמים מערביים, אם כי immunolabeling מספק מדד של ביטוי חלבון ולוקליזציה. למרות מגבלות אלה, צינור אנדותל מייצג הכנה חדשנית למתן תובנה חדשה מנגנונים של תפקוד תא אנדותל כלי הדם בגוף חי.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבידוד של צינורות תא האנדותל מהים העכבר. הים נובע מהדם בעורק ואספקת בית החזה הפנימי מחומצן לשרירי בטן הקדמי. שלנו עובד עם הים כמודל ניתן לייחסו לזה מתן מגזרים ארוכים יחסית, unbranched דם קטן שמתאים גם ללימוד אירועי איתות אינטר בדבר תפקידה הבסיסי של האנדותל בשלטון ותיאום הרפיה תא שריר חלק. למעוניינים ברקמות אחרות מאשר שרירי שלד, מצאנו בטכניקה זו כדי להתאים בקלות להשגת צינורות אנדותל מmicrovessels של מערכת הלימפה במוח, מעיים ו. התכונות העיקריות של שיטה זו הן שאורכים שלמים (1-3 מ&quot;מ) של האנדותל כלי הדם מבודדים, מאובטח נגד coverslip זכוכית בתא זרימה שבו הם superfused עם PSS, וצלמת עבור Ca 2 + איתות 7-9 אומשופד ל6,8 איתות החשמלי. בתוך תא הזרימה, חיצו העליון של צינור חשוף לפתרון superfusion ומגיב להתערבויות ניסיוניות, בעוד החצי התחתון (במגע עם coverslip) מוגן ונשאר שקט. בנוסף ללימוד שני 2 אירועי Ca התוך ואינטר + איתות, צינורות האנדותל יכולים לשמש בזמן אמת PCR כמוני להערכת ביטוי גני 6,10, אימונוהיסטוכימיה לחקור ביטוי חלבון 6,10, ומחקרי אלקטרו להגדיר מאפייני biophysical של 6,11 הולכה חשמליות. ישנם מספר יתרונות להכנת צינור אנדותל ללימוד תפקוד האנדותל. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק הבחנה פשוטה בין שתי אוכלוסיות תאים: תאי האנדותל (שיישארו בהיווצרות צינור) ותאי שריר חלק (ניתקה בנפרד, בדרך כלל &quot;C&quot; בצורה שבירגוע). זה מאפשר לדגימה ומחקר של מאפיינים ייחודיים שבבסיס תרומת תאי בהתאמה לתפקוד כלי סלקטיבית. שנית, מודל זה מאפשר הרזולוציה של איתות אירועים מהותיים לאנדותל, עצמאי מההשפעה של זרימת הדם, המקיף את שריר חלק, עצבים, וparenchyma. שלישית, האנדותל הוא למד תוך מבודד טרי, ובכך להימנע משינויים בגן או ביטוי חלבונים הקשורים בתרבית תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

השליטה על זרימת דם בכלי הדם על ידי ההתנגדות מווסתת את אספקת חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של חילוף חומרים לפי מוצרים, כפי שהודגמה על ידי פעילות גופנית שרירי שלד. תאי אנדותל (ECs) מרפדים את אינטימה של כל כלי ההתנגדות ולשרת את התפקיד מרכזי בשליטה בקוטר (vasodilation למשל תלוי האנדותל), ובכך, את הגודל וההפצה של זרימת דם לרקמות. הרגולציה של התנגדות כלי דם על ידי ECs הוא התבצע על ידי Ca 2 + איתות תאית, שמובילה לייצור של autacoids diffusible (למשל תחמוצת חנקן ומטבוליטים חומצה הארכידונית) 1-3 וhyperpolarization 4,5 כי לעורר רגיעה תא שריר חלק. לכן הבנה של הדינמיקה של Ca 2 + איתות אנדותל היא צעד מפתח להבנת מנגנונים המסדירים בקרת זרימת דם. בידוד צינורות אנדותל מבטל משתנים מבלבלים קשורים blood בלומן הכלי ועם תאים המקיפים את שריר חלק ועצבי perivascular, אשר אחרת להשפיע על מבנה EC ותפקוד. כאן אנו מציגים את הבידוד של צינורות האנדותל בעורק מעולה ברום הבטן (SEA) באמצעות פרוטוקול מותאם לכלי זה. כדי לבודד צינורות אנדותל מעכבר הרדים, הים הוא את הגבעול באתר כדי לשמור על דם בתוך לומן הכלי (כדי להקל על לדמיין את זה בזמן נתיחה), ואת כל הגיליון של שרירים בטן הוא נכרת. הים הוא גזור חופשי מסביב סיבי שריר שלד ורקמות חיבור, דם סמוק מהלום, ועיכול אנזימטי מתון מתבצע כדי לאפשר הסרת adventitia, עצבים ותאי שריר חלק באמצעות טחינה דקה עדינה. הכנות טריות מבודדים אלה של האנדותל בשלמות לשמור על המורפולוגיה האם שלהם, עם ECs הבודד שנותר בשילוב פונקציונלי זו לזו, תוכל להעביר כימית וחשמלי signals intercellularly דרך צמתים פער 6,7. בנוסף לאספקת תובנה חדשה ביופיסיקה איתות סיד והקרום, הכנות אלה יאפשרו מחקרים מולקולריים של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון בתוך האנדותל כלי הדם מקומי.

יכולות להיות יזם תגובות סידן בצינורות מבודדים טרי אנדותל באמצעות אצטילכולין (ACH). בסרט הזה, צינור אנדותל עמוס 10 מיקרומטר fluo-4 AM האם מגורה עם superfusion של מיקרומטר ACH 1 (סרט 1). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> הצבע הוא נרגש ב491 ננומטר ופליטה נרשמת 500-550 ננומטר באמצעות מצלמת מכשיר תשלום מצמידים התעצמה. ערימות תמונה נרכשות ב120 פריימים / השני לתקופה שניות 25 ואז יכולות להיות בממוצע (למשל ל40 מסגרות / sec). תמונות הקרינה נציג לאורך הזמן מוצגות באיור 4. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. תא הזרימה וטפטפות שימוש במהלך הבידוד של צינורות אנדותל. </stro<html> ng&gt;) דוגמאות תא הזרימה מורכבת עם coverslip זכוכית x 50 מ&quot;מ 24 מ&quot;מ כבסיס. ב) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה, מלוטשת וזווית cannulation. פיפטה זה משמשת כדי לשטוף אריתרוציטים מלומן של העורק לאחר נתיחה. דוגמאות בקנה מידה בר = 200 מיקרומטר. ג) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה ומלוטשת טחינה דקה. הקוטר הפנימי של פיפטה זה נקבע על ידי הקוטר החיצוני של העורק. דוגמאות בר סולם = 200 מיקרומטר. ד) פיפטה משכה, שבורה ומלוטשת (משך (משמאל) וימין) מצמיד. קצה פיפטה זה מעוגל ואטום לגמרי כדי לאבטח את צינור אנדותל בתא הזרימה. בר = 200 מיקרומטר קנה המידה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> class = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק להדמיה של Ca 2 + אותות.) מיקרוסקופ הזקוף המשמש להדמית סידן. (א) יחידת דיסק ספינינג confocal עם מטרות טבילה (ב) התעצמה מצלמה מכשיר תשלום מצמידים. ג) (א) 63X (ב &#39;) NA = 1) ו (ב) 20X (NA = 0.5) המשמש להדמיה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. בידוד של השרירים הבטן ועורק ברום הבטן מעולה. </st<html> rong&gt;) מורדם עכבר עם שרירי בטן חשופה ושלחין עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. חיצים אדומים מסמנים את האתרים תחת רפידות שומן שבימי בהתאמה להיכנס כל שריר rectus abdominis (כלומר היכן יש מקשרים את כלי דם). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. B) שרירים בטן מבודדים (חד צדדי) וSEA תלו בחדר נתיחה לmicrodissection. חץ אדום מציין את האתר הגדול הראשון של הסתעפות של הים (כלומר, הנקודה שבה ניקוי של הכלי הופסק). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. C) צינור מבודד אנדותל תא מים. תמונת ההפרש התערבות ניגודיות של צינור אנדותל הבא דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר. צינור אנדותל היה superfused עם חיץ superfusion ב3 מיליליטר / דקה. בר = 50 מיקרומטר קנה המידה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> ether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. הקרינה סידן בצינור תא האנדותל. תמונות ניאון נציג של צינור אנדותל בתגובה לגירוי עם אצטילכולין 1 מיקרומטר.) פלואורסצנטי לפני גירוי. ב &#39;) הקרינה צינור אנדותל בזמן ממשל אצטילכולין, t = 0 שניות. C) הקרינה צינור אנדותל ב t = 5 שניות. ד) הקרינה צינור אנדותל ב t = הקרינה 10 שניות. E) אנדותל צינור ב t = 15 שניות הקרינה צינור אנדותל. F) בזמן t = 20 שניות. ברים סולם = 40 מיקרומטר. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Isolation of Valvular Endothelial Cells

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...