Name: isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries
Uploaded: 2013-11-25T21:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

Авторы благодарят доктора Pooneh Багер и доктора Эрика Уэсткотта в редакционных комментариев в подготовке рукописи. Эта работа была поддержана крови Института Национальных Институтов Здоровья Национального сердца, легких и под номерами премии R37-HL041026 и R01-HL086483 к SSS и F32-HL107050 чтобы MJS. Этот контент исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li><li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists.">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li><li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells.">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li><li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDHF:+bringing+the+concepts+together.">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li><li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-activated+K++channels+in+murine+endothelial+cells:+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium.">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li><li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2++in+arteriolar+endothelial+cells.">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li><li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries.">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li><li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels,+local+Ca2++events,+and+IKCa+channels,+reducing+arteriolar+tone.">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li><li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II:+new+insights+from+genetic+models.">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li><li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries:+role+in+vasomotor+control.">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li><li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections.">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li><li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Ca2++wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback.">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li><li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2++signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries.">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li><li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+endothelial+cell+Ca2++in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction.">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li><li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li><li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells.">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li><li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li><li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

Ни один.

Здесь мы опишем изоляцию эндотелиальных трубок от моря и использование этого препарата для визуализации Ca 2 + сигнализации события в своем учредительном ЭК. Эта процедура была приспособлена от одного первоначально разработанной для изоляции эндотелиальные трубки от артериол хомяк мышц кремастер 8. Используя незначительные изменения в техниках здесь, мы выделили эндотелиальные трубки из различных сосудистых бассейнах, в том числе: кормовых артерий хомяк втягивающего мышцы и щеку мешок артериол 10, мыши высшего эпигастральной артерии 6,7,9, мыши брыжеечной и церебральная артерии и лимфатические микрососудов (неопубликованные наблюдения; ссылки включены для изоляции сосудов брыжейки 12 и сосудов головного мозга 13). Изоляция эндотелиальные трубки от новых сосудистых бассейнах может потребовать изменения в оригинальной протокола. Если изоляция не удалась, то лучше начать с изменения раз пищеварения:Увеличение времени пищеварение, если эндотелиальные трубки трудно отделить от гладкомышечных клеток и адвентиции и сократить время пищеварения, если эндотелиальной трубки не остается неповрежденной. Если изменения раз пищеварения неудачно, регулируя концентрацию пищеварения ферментов или температуру пищеварения должны предстать перед судом. Другой вариант заключается в уменьшении внутреннего диаметра растиранием пипетки, что увеличивает усилие сдвига при удалении гладкомышечных клеток. Увеличение скорости выброса жидкости может быть также пытались с тем же эффектом, но, скорее всего, привести к повреждению препарат. Следует признать, что оно не может быть возможным выделить неповрежденные эндотелиальные трубки из сосудов, в которых эндотелиальные клетки не очень хорошо соединены друг с другом с помощью соединительных белков. Разобщенность гладкомышечных клеток следующем ферментативного расщепления был первоначально осуществляется с помощью ручной стиль пипетки 8. Мы усовершенствовали процедуру растирания с помощью microsyrСистема Инге, что позволило последовательно изоляцию более эндотелиальных трубок (до 3 мм) 6. При использовании этой системы, растирание пипетки заполняют минеральным маслом, чтобы обеспечить непрерывную столба жидкости между поршнем управления перемещением жидкости и PSS, содержащий сегмент сосуда. Несжимаемости жидкости вместе с постоянной движущей силой микрошприцом результатов поршень в постоянном сдвиге в качестве сосуда продавливают через кончика пипетки. В противоположность этому, методы руки часто используемые для диссоциации клеток (например, сжимая резиновую грушу в конце пипетки Пастера) включает сжатие воздуха, который вводит изменчивость в давлении вождения и, таким образом, сдвиг, оказываемое на кончика пипетки. Есть несколько преимуществ для подготовки труб для изучения функции эндотелия в микрососудов. Во-первых, процесс изоляции обеспечивает различные однородные родные клеточные популяции ЭК и гладкой муSCLE клетки. Поскольку ЭК остаются физически подключен как трубы, они отличаются от индивидуальных клеток гладких мышц, которые сохраняют конфигурацию &quot;C&quot;, если они остаются расслабился во время растирания. Таким образом соответствующие типы клеток легко отличить, например, при получении образцов для молекулярных методов, таких как ПЦР в реальном времени и иммуногистохимии 10. Поскольку несколько труб изолированы от одного сосуда (или из двусторонних сосудов, что и для SEA), молекулярные данные и функциональные данные могут быть получены из тех же самых сосудах данного животного. Таким образом молекулярная выражение может быть связано с функциональной поведения микрососудистой эндотелия. Кроме того, события и внутри-и межклеточные сигнальные присущие микрососудов эндотелия могут быть решены независимым от влияния гемодинамических сил (давления, расхода), вазоактивных агентов, проведенных в крови (например, гормонов), или от окружающих клеток гладкой мускулатуры (например,60; через myoendothelial связи 14-16), нервы 17, или ткань паренхимы 18. Важно отметить, что так как эндотелий недавно выделен из указанных микрососудов, нет изменение фенотипа, который в противном случае связан с культивирования ECS 19-21. Например, культивируемые ЭК потерять мускариновый экспрессии рецептора и тем самым изменить свои профили сигнализации кальция. Кроме того, электрофизиологические свойства ЭК можете изменить в культуре 22. Поскольку отдельные ЭК остаются соединены через функциональных щелевых контактов каналов, эндотелия трубка представляет собой идеальную модель для изучения проводимость электрических и Са 2 + сигналов между клетками 6,7. Следует также признать, что диссоциированные гладкомышечных клеток легко учился с методами патч-зажим для дополнительных данных, лежащих в основе микрососудов функцию 23. Основным ограничением в эндотелиальных трубки мOdel является неустойчивость препарата с увеличением температуры. В то время как наши препараты от моря доказали стабильной и здоровой при комнатной температуре окружающей среды (~ 24 ° C) и в течение нескольких часов при 32 ° С, морфологических и функциональная деградация происходят в менее чем за час при 37 ° С 9. Вторым важным ограничением эндотелиальной трубки является потеря myoendothelial развязок и присущих им доменов передачи сигналов, которые являются неотъемлемой частью функции ЕС в неповрежденной стенки сосуда 14-16. Следует также признать, что, в то время как более длинные трубки позволяют межклеточной сигнализации должны быть изучены в течение относительно большие расстояния 6, подготовка труб осложняется, поскольку они становятся больше, потому что она становится все более трудно полностью отделить окружающих клетки гладких мышц и адвентиции. Мы обнаружили, что трубы длиной более 1-2 мм и более трудно расположить и закрепить в проточную камеру. В противоположность этому, в то время как более короткие трубы (например, &lt;1 мм) ЕСАBLE Ca 2 + и электрические сигналы подлежащие изучению 8, их трудно поддерживать в течение суперфузии в проточную камеру. Наконец, даже при оптимальном изоляции труб в двустороннем, недостаточно материала для традиционной количественной оценки экспрессии белка с помощью вестерн-блот, хотя иммуномечение обеспечивает индекс экспрессии белка и локализации. Несмотря на такие ограничения, эндотелия трубка представляет собой новый препарат для предоставления новому взглянуть на механизмы микрососудов эндотелиальной функции клетки в естественных условиях.

В этом протоколе, мы описывают выделение эндотелиальных клеток труб от моря мыши. СЭО возникает из внутренней грудной артерии и поставок кислородом крови к передней брюшной мускулатуры. Наша работа с моря в качестве модели объясняется это обеспечить относительно длинные, неразветвленные сегменты микрососудов, которые хорошо подходят для изучения межклеточных сигнальных событий, лежащих в основе роли эндотелия в управлении и координации расслабление гладкомышечных клеток. Для тех, кто интересуется, кроме скелетных мышц тканей, мы нашли эту технику, чтобы быть легко адаптированы для получения эндотелиальных трубок из микрососудов мозга, кишечника и лимфатической системы. Ключевыми особенностями этого метода в том, что неповрежденные длины (1-3 мм) из микрососудов эндотелия изолированы, защищены от покровным стеклом в проточной камере, в которой они орошали PSS, и отображается на Ca 2 + сигнализации 7-9 илипронзил для электрического 6,8 сигнализации. В проточной камере, верхняя половина трубки подвергается суперфузии раствора и реагирует на экспериментальных вмешательств, в то время как нижняя половина (в контакте с покровным) защищена и остается в состоянии покоя. В дополнение к изучению как внутри-и межклеточные Ca 2 + сигнальных событий, эндотелиальные трубки могут быть использованы для количественной ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии генов 6,10, иммуногистохимия исследовать экспрессию белка 6,10 и электрофизиологических исследований, чтобы определить биофизические свойства электрической 6,11 проводимости. Есть несколько преимуществ для подготовки эндотелия трубки для изучения функции эндотелия. Во-первых, что процесс изоляции обеспечивает простое различие между двух клеточных популяций: эндотелиальные клетки (которые остаются в формировании трубки) и клеток гладкой мускулатуры (индивидуально диссоциированной; обычно &quot;С&quot; формы, когдарасслабленным). Это позволяет для селективного отбора проб и исследования уникальных свойств, лежащих в основе вклад соответствующих клеток к функции сосудов. Во-вторых, эта модель обеспечивает разрешение сигнальных событий присущи эндотелий, независимо от влияния кровотока, окружающих гладкие мышцы, нервы, и паренхиму. В-третьих, эндотелий изучается в то время как свежевыделенную, тем самым избегая изменений в гене или экспрессии белка, связанного с клеточной культуре.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

Контроль кровотока по сопротивления сосудистой регулирует подачу кислорода и питательных веществ, одновременно с удалением продуктов метаболизма, о чем свидетельствует, осуществляя скелетные мышцы. Эндотелиальные клетки (ECS) выравнивают интиму всех резистивных сосудов и служить ключевую роль в контроле диаметра (например эндотелий-зависимой вазодилатации) и, тем самым, величина и распределение тканевого кровотока. Регулирование сосудистое сопротивление по ЭК осуществляется путем внутриклеточного Са 2 + сигналов, что приводит к производству диффундирующих физиологически активные вещества (например, окись азота и метаболитов арахидоновой кислоты) 1-3 и гиперполяризации 4,5, что вызывают расслабление гладкомышечных клеток. Таким образом понимания динамики эндотелиальной Ca 2 +-сигнализации является ключевым шагом на пути к пониманию механизмов, регулирующих управление потоком крови. Изоляция эндотелиальные трубки исключает вмешивающихся переменных, связанных с блOOD в просвете сосуда и с окружающими клетками гладких мышц и периваскулярными нервов, которые в противном случае влияют на структуру и функцию EC. Здесь мы представляем изоляцию эндотелиальных трубок от вышестоящего эпигастральной артерии (СЭО) с использованием протокола оптимизированный для этого судна. Для выделения эндотелиальных трубок из под наркозом мыши, СЭО, лигирована месте для поддержания крови в просвете сосудов (для облегчения визуализируя ее во время вскрытия), а весь лист брюшной мышцы вырезали. СЭО отсекали от окружающих скелетных мышечных волокон и соединительной ткани, кровь очищается от просвета, и мягкий ферментативное расщепление выполняется для того, чтобы удаление адвентиции, нервов и клеток гладкой мускулатуры, используя мягкое растирание. Эти свежих изолированных препараты интактным эндотелием сохранить их родной морфологию, с индивидуальным ЭК остальные функционально соединены друг с другом, в состоянии передавать химических и электрических сиgnals межклеточно через щелевые контакты 6,7. В дополнение к предоставлению новому взглянуть на сигнальных кальция и биофизики мембран, эти препараты позволяют молекулярные исследования экспрессии генов и локализации белков в родном микрососудов эндотелия.

Ответы кальция может быть инициировано в свежевыделенных эндотелиальных трубок с использованием ацетилхолина (АХ). В этом фильме, эндотелия трубка загружен 10 мкМ Fluo-4 утра стимулируется суперфузии 1 мкМ АХ (Movie 1). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм</a> . Краситель возбуждается на 491 нм и эмиссии записывается с 500-550 нм, используя усиленную камеру устройства с зарядовой связью. Стеки изображения приобретаются на 120 кадров / сек в течение 25 сек и может быть в среднем (например, 40 кадр / с). Представительства флуоресцентные изображения с течением времени показаны на рисунке 4. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> Рисунок 1. Расход камеру и пипетки, используемые в процессе выделения эндотелиальных трубок. </stroнг&gt;) проточной камеры собран с 24 мм х 50 мм покровным стеклом в качестве базового. B) Примеры вытащил (слева) и вытащил, сломанной, полированной и угловым (справа) катетеризации пипетки. Эта пипетка используется для промывки эритроцитов из просвета артерии следующее вскрытия. Шкала бар = 200 мкм. C) Примеры вытащил (слева) и вытащил, сломанные и полированной (справа) тритурационного пипетки. Внутренний диаметр этой пипетки определяется Внешний диаметр артерии. Шкала бар = 200 мкм. D) Примеры вытащил (слева) и вытащил, разбитого и полированной (справа) закрепления пипетки. Кончик этой пипетки округляется и полностью герметичен, чтобы закрепить эндотелия трубку в проточную камеру. Шкала бар = 200 мкм. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение</a> . <pкласс = &quot;jove_content&quot; FO: держать-together.within-страницу = &quot;всегда&quot;&gt; <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> Рисунок 2. Вращающийся диск конфокальной микроскопии для визуализации Са 2 + сигналов.) Вертикальный микроскоп используется для работы с изображениями кальция. B) (а) блок конфокальной спиннинг диск с (б) усилились с зарядовой связью Камера устройства. C) Погружные целей (а) 63x ( NA = 1) и (б) 20X (NA = 0,5) используется для работы с изображениями. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение</a> . <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> Рисунок 3. Выделение брюшной мышцы и превосходит в эпигастрии артерии. </stРонг&gt;) под наркозом мышь с брюшной мышцы подвергаются и орошаемых с комнатной температуры 0,9% солевого раствора. Красные стрелки отмечают участки под жировых отложений, при которой соответствующие СЭО вводить каждый прямой мышцы живота (то есть где суда должны быть лигированный). Шкала бар = 1 см. Б) Изолированный мышца живота (в одностороннем порядке) и SEA возлагали в рассечение камеры для микродиссекции. Красная стрелка указывает первый крупный сайт бифуркации моря (т. е. точки, в которой очистка судна останавливается). Шкала бар = 1 см. C) Изолированный эндотелия трубка сотового от моря. Дифференциальный интерференционный контраст образ эндотелиальной трубки следующем 1 ч инкубации при комнатной температуре. Эндотелиальный трубку орошали буфером при суперфузии 3 мл / мин. Шкала бар = 50 мкм. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение</a> . Рисунок 4. Флуоресценции кальция в эндотелиальной трубки клеток. Представительства флуоресцентные изображения эндотелиальных трубки в ответ на стимуляцию 1 мкМ ацетилхолина.) Флуоресценции до стимуляции. B) флуоресценции эндотелия трубка на момент введения ацетилхолина, т = 0 сек. C) эндотелия трубка флуоресценции при Т = 5 сек. D) эндотелия трубка флуоресценции при Т = 10 сек. Е) эндотелия флуоресценции трубки при Т = 15 сек. F) эндотелия флуоресценции трубки при Т = 20 сек. Масштабные бары = 40 мкм. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Мы представляем подготовку к визуализировать и манипулировать сигнализации кальция в родном, неповрежденной микрососудов эндотелия. Эндотелиальные трубки свежевыделенные от мыши артерий сопротивления, поставляющих скелетных мышц сохранить в естественных условиях морфологии и динамического сигнализации внутри и между соседними клетками. Эндотелиальные трубы могут быть получены из микрососудов других тканей и органов.

Выделение микрососудистой эндотелиальных трубок от сопротивления мышь автомагистралях

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...