Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

نشكر Jongmin كيم، دان سيغال-Gaskins، أنو Thubagere، واينوك يونغ للمساعدة تبسيط البروتوكول، وكلير تشن لي وباركلي للمساعدة في المراحل الأولى من المشروع. ويستند هذه المواد على العمل بدعم جزئي من وكالة مشاريع أبحاث الدفاع المتقدمة (داربا / MTO) برنامج المعيشة مسابك، عدد العقد HR0011-12-C-0065 (معتمد داربا / CMO.ZZS أيضا من قبل العلماء في جامعة كاليفورنيا الطبي / معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا برنامج الزمالة التدريبية من قبل وزارة الدفاع، وجهات النظر والاستنتاجات الواردة في هذه الوثيقة هي آراء المؤلفين، وينبغي ألا يفسر القوات الجوية مكتب البحث العلمي والعلوم الدفاع الوطني وخريج كلية الهندسة (NDSEG) زمالة، 32 CFR 168A. كما تمثل رسميا السياسات، إما صراحة أو ضمنا، من وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع أو الحكومة الأمريكية.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

والإشريكية القولونية الذاتية استنادا TX-TL نظام التعبير خالية من الخلايا الموصوفة هنا هو وسيلة سهلة للتشغيل أنبوب ثلاثة ردود الفعل التي يمكن أن تستغرق أقل من ثماني ساعات من وضع لجمع البيانات. عملية إنشاء جميع الكواشف يتطلب خمسة أيام الوقت الكلي (مع متطلبات العمل كبيرة في يوم واحد فقط)، ولكن تنتج استخراج النفط الخام ل3،000 ردود الفعل وردود الفعل الكواشف ل10،000 (الشكل 1) صنع العازلة. وعلاوة على ذلك، واستخراج النفط الخام والكواشف مستقرة لا يقل عن 1 سنة في -80 درجة مئوية، مما يسمح لاستخدامات متعددة من التحضير واحد صنع العازلة 4. في 0،11 $ لكل 10 رد فعل ميكرولتر (0،26 $ بما في ذلك العمل)، وتكاليف أقل 98٪ من مقارنة الأنظمة التجارية (الشكل 2). هناك بعض القيود التي لم تحل، ولكن، إلى النظام. كفاءة نهاية كل خلية إعداد مستخلص الخام يمكن أن تختلف على أساس الكفاءة المستخدم وعلى الظروف البيئية، على الرغم من راختلاف العائد ypical ما بين 5-10٪ (الشكل 4B). ونتيجة لذلك، وتقلب دفعة إلى دفعة في كل من التعبير نقطة النهاية وديناميكية في التعبير وينتظر أن تتم. ومن المرجح أن تظل هذه الاختلافات حتى يتميز استخراج بالكامل أو حتى يتم إنشاء آلية استخراج بالكامل. إذا تم استخدام نظام التعبير خالية من الخلايا لإجراء التجارب الكمي الحساسة، فإنه من المستحسن لتشغيل جميع التجارب مع نفس دفعة من استخراج الخلايا الخام. العائد من نفس واحدة استخراج الخام دفعة الخلية، حوالي 3000 ردود الفعل، ينبغي أن يكون كافيا لدورات تجريبية نموذجية. على الرغم من أن نشك يمكن إزالة الاختلاف من خلال زيادة وأتمتة الإجراءات، فإن مثل هذه المحاولات تنطوي على استثمار الموارد كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن مستويات نقطة النهاية التعبير هي سهلة لتحديد معقول، يحتاج إلى المزيد من العمل الذي يتعين القيام به في فهم الديناميات الجوهرية لنظام خالية من الخلايا. ومن المعروف أن كلا competitio المواردن والموارد قيود يمكن أن تؤثر على ديناميات التعبير. على سبيل المثال، يمكن محدودة سيغما الذاتية 70 يؤدي إلى تشبع النظام مع زيادة إنتاج الحمض النووي قالب ملف تعريف التعبير مماثلة لتلك التي النوكليوتيدات أو استنزاف الأحماض الأمينية. 9،27 ومع ذلك، وديناميات لا يجب أن تكون مفهومة تماما للاستفادة من النظام. لزيادة نقية من الغلة، ويمكن أن يتم من خلال النهج الأمثل آلة التعلم. 28 أسئلة من التنافس على الموارد والحد يمكن معالجتها من خلال نماذج رياضية التحقق باستخدام البيانات التجريبية. هو الأمثل لبروتوكول المعروضة هنا للحصول على سلالة BL21-Rosetta2، ولكن هو للتعميم إلى أخرى E. سلالات القولونية. تعديلات في BL21-Rosetta2، مثل إزالة الجين الترميز خط الطول البروتيني وإضافة ترميز الجينات tRNAs نادرة، والسماح لإنتاج البروتين القصوى. حاولنا بروتوكول مع اثنين من سلالات استخراج أخرى - BL21 BL21 فقط وtrxA خروج المغلوب، ووجد د 50٪ أقل من البروتين العائد. نحن نفترض أن الغلات تنخفض بالمثل عند استخدام السلالات الأخرى. ، وقد أدت التغييرات الأخرى في المعلمات، مثل تبديل 2xYT متوسطة النمو لLB والمرق الغنية الأخرى في تناقص الغلة البروتين. نظم التعبير خالية من الخلايا باستخدام الداخلية والخارجية على حد سواء آلات النسخ الترجمة وآليات التنظيم لها تطبيقات واسعة في كل من البروتين والأيض والتعبير في البيولوجيا التركيبية. 3،29 بدلا من أن يقتصر على دوائر التنظيم T7، يمكن للمرء أن يتصور إنتاج الجزيئات الحيوية المعقدة في وضع المستخدم السيطرة عليها باستخدام مزيج من الأم E. المروجين القولونية وآليات النسخ وتنظيم الموردة خارجيا. دون قيود من انقسام الخلايا والتمثيل الغذائي، وتقلب في الدوائر الاصطناعية مثل repressilator أو في التمثيل الغذائي المهندسة مسارات مثل تلك التي تنتج مادة الأرتيميسينين يمكن تخفيض أو مفهومة على نحو أفضل. 30،31 نحن هفه تستخدم هذه المزايا لتنفيذ مفاتيح الوراثية، وكذلك لفهم سيغما عامل تنحية يمكن 9،32 هذه التكنولوجيا أيضا تشكل العمود الفقري لل&quot;الحد الأدنى&quot; أو خلايا &quot;مصطنعة&quot; - صغيرة، وتتميز بشكل جيد وحدات المجسدة الاكتفاء الذاتي من استخراج. 33،34 في نهاية المطاف، ونحن نتوقع الاستخدامات الفوري لهذا النظام حرية التعبير الخلايا الذاتية كبيئة النماذج للبيولوجيا الاصطناعية. الملقب ب &quot;TX-TL اللوح الجزيئية البيولوجية،&quot; يوفر نظام حرية التعبير خلايا بيئة يمكن السيطرة عليها حيث الدوائر الاصطناعية المخصصة في نهاية المطاف لفي الجسم الحي التعبير يمكن أن تخضع لجولات من النماذج - دورات الاختبار على البلازميد الأساسية، الخطي، أو الحمض النووي synthetized كيميائيا، يليه عن طريق التحليل والتعديل السريع. جولات النماذج يمكن بمساعدة النماذج الرياضية التنبؤية التي يجري تطويرها حاليا. عن طريق إزالة الاستنساخ والتلاعب في الجسم الحي للدوائر غير نهائية، ونحن نتوقع إنجيدورة مرات neering أن تنخفض إلى 1-3 أيام بدلا من معيار الأسابيع الحالية.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

بدأت التكنولوجيا التعبير خالية من الخلايا في 1950s باعتبارها متعدية بحتة، والنهوض بعد سنوات لتشمل آليات النسخ الترجمة يقترن باستخدام الحمض النووي البكتيريا T7. 11،12 ومنذ ذلك الحين، بذلت جهود عديدة لتحسين إنشاء خلية استخراج الخام (أو E وتشمل. استخراج القولونية S30). 13،14 هذه التحسينات إطالة تخليق البروتين خالية من الخلايا من خلال تجديد ATP أو تعديلات السلالة، وتقليل الوقت والتكلفة بروتوكول. موجودة 15-17 نظم التعبير خالية من الخلايا البديلة التي أعيد استخدام مكونات بدلا من النفط الخام وقد وضعت استخراج خلية للتعبير. 5 كلا استخراج خلية الخام وأساليب إعادة للاستخدام التجاري. مع ظهور علم الأحياء الاصطناعية، وهناك حاجة متزايدة لمنصة تتميز جيدا لاختبار والتعبير عن وحدات ودوائر البيولوجية هندسيا. 18،19 يجب أن تكون هذه المنصةتنوعا، يتميز بشكل جيد، وسهلة التعامل معها، وتركز على مكونات الموفر من قبل المستخدم. على الرغم من كونها وضعت نصف قرن في وقت سابق، وأنظمة خالية من الخلايا استنادا إلى E. القولونية مشاركة في جوهرها هذه المتطلبات، كما هي مبسطة في التمثيل المختبر من العمليات الخلوية دون تعقيد النمو والأيض. بالإضافة إلى ذلك، كل من المعرفة التأسيسية من العمل في الجسم الحي على E. ينطبق القولونية E. بسهولة ل نظم خالية من الخلايا القولونية. على الرغم من أن أنظمة التعبير خالية من الخلايا يمكن أن تكون لها تطبيقات في مجال البيولوجيا الاصطناعية، وحتى الآن الهدف من معظم النظم التعبير خالية من الخلايا كان تعظيم العائد من البروتين والأيض. ويتم إنجاز هذا باستخدام البكتيريا T7 النسخ من تسلسل يقودها المروجين T7 20 على الرغم من أن التعبير هو كفاءة وقوية، وهذه النظم تخدم غرضا درجة عالية من التخصص. طرق تنظيم خلية محدودة، ويجب أن تكون قوالب الحمض النووي المستهدفصياغتها لتشمل المروجين T7، وبعض متواليات مثل المجمعات الريباسي لا يمكن نسخها وتجميعها. 21،22 نظم التعبير خالية من الخلايا الموجودة غير قادرة على الحفاظ على عوائد عالية مع الحفاظ على الآليات التنظيمية الذاتية، وبراعة اللازمة للبيولوجيا الاصطناعية. قمنا بتطوير E. الذاتية القولونية خالية من الخلايا نظام التعبير الذي يحافظ على كفاءة البروتين التعبير يتبين من الأنظمة السابقة ولكنها تضيف براعة إضافية من خلال السماح التعبير والتنظيم على أساس كل من (T7 أو غيرها) آليات الداخلية والخارجية. بروتوكول الموصوفة هنا يستند أصلا على Kigawa وآخرون (2004) وليو وآخرون (2005)، ولكن لديه تعديلات كبيرة. فإنه يستخدم المغنيسيوم وK-الغلوتامات على المغنيسيوم وK-خلات لزيادة الكفاءة، ويزيل 2 المركابتويثانول، وlyses الخلايا باستخدام حبة الخافق. يتم اختيار 17،23،24 الخرزة ضرب على التجانس،على أساس أساليب الضغط، أو صوتنة بسبب انخفاض تكلفة وعائدات مماثلة لأنظمة المتنافسة. يستخدم حمض 23 3 phosphoglyceric (3-PGA) كمصدر للطاقة كما وجد أن تعطي غلة البروتين متفوقة بالمقارنة مع فوسفات الكرياتين و الفسفوإينول. 4،25 نظامنا يمكن ان تنتج ما يصل الى 0.75 ملغ / مل من البروتين مراسل باستخدام إما المروج القائم على sigma70 مع مشغلي امدا فج أو المروج T7 يحركها، مماثلة لغلة من الأنظمة التجارية الأخرى. 4،6 خمسة أيام هناك حاجة لانتاج جميع الكواشف اللازمة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر خفض التكاليف 98٪ بالمقارنة مع أنظمة مماثلة خالية من الخلايا التجارية - التكاليف المادية هي 0،11 $ لكل 10 ميكرولتر رد فعل، والتي ترتفع إلى 0،26 $ مع تضمين العمل (الشكل 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

ويمكن لنظم التعبير خالية من الخلايا مثالية نظريا محاكاة بيئة الخلوية في الجسم الحي في رقابة في منصة المختبر. 1 وهذا مفيد للتعبير عن البروتينات ودوائر الوراثية في الطريقة التي تسيطر عليها فضلا عن توفير بيئة النماذج الأولية للبيولوجيا الاصطناعية. 2،3 لتحقيق هذا الهدف الأخير، ونظم التعبير خالية من الخلايا التي تحافظ على آليات النسخ الترجمة الذاتية كولاي هي قادرة أن تعكس بشكل أكثر دقة في الجسم الحي ديناميات الخلوية من تلك القائمة على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 النسخ. نحن تصف إعداد وتنفيذ وكفاءة الذاتية E. القولونية يستند النسخ الترجمة (TX-TL) خالية من الخلايا نظام التعبير التي يمكن أن تنتج كميات من البروتين كما تعادل النظم القائمة T7-في خفض التكاليف 98٪ إلى النظم التجارية مشابهة. 4،5 إعداد مخازن واستخراج خلية الخام وصفها، وكذلك تنفيذا لثلاثة أنبوب TX-TL رد الفعل. بروتوكول كامل يستغرق خمسة أيام لإعداد وينتج ما يكفي من المواد لمدة تصل إلى 3000 ردود فعل واحد في التحضير واحد. مرة واحدة على استعداد، ويأخذ كل رد فعل أقل من 8 ساعة من الإعداد لجمع البيانات وتحليلها. آليات التنظيم والنسخ الخارجية إلى E. القولونية، مثل repressors أمريكا اللاتينية والكاريبي / تيت وT7 RNA البلمرة، يمكن أن تستكمل. 6 الخصائص الذاتية، مثل مرنا ومعدلات تدهور الحمض النووي، كما يمكن تعديلها. 7 وقد تجلى هذا النظام حرية التعبير خلايا TX-TL لواسع تتوفر الجمعية على نطاق الدائرة، واستكشاف الظواهر البيولوجية، والتعبير عن البروتينات في إطار كل من المروجين T7 والذاتية. 6،8 النماذج الرياضية المصاحبة. 9،10 النظام الناتجة لها تطبيقات فريدة من نوعها في مجال البيولوجيا التركيبية وبيئة النماذج، أو &quot;TX- TL الجزيئية البيولوجية اللوح &quot;.

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

يحدد هذا البروتوكول لمدة خمسة أيام كل الخطوات والمعدات والبرمجيات اللازمة تكميلية لخلق وتشغيل فعال الذاتية القولونية يستند TX-TL نظام التعبير خالية من الخلايا من الصفر. مع الكواشف، وبروتوكول يأخذ 8 ساعات أو أقل لإعداد رد فعل، وجمع، ومعالجة البيانات.

بروتوكولات لتنفيذ و<em&gt; كولاي</em&gt; وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن<em&gt; المتصورة</em&gt; المقيرع البروتينات

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

التأسيس-بقايا محددة من Noncanonical الأحماض الأمينية في البروتينات نموذج باستخدام<em&gt; كولاي</em&gt; نظام النسخ، ترجمة خالية من خلية

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...