Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Vi takker Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere og Enoch Yeung for assistance strømline protokollen, og Clare Chen og Barclay Lee om bistand i de tidlige faser af projektet. Dette materiale er baseret på arbejde støttes delvist af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Støberier program, kontrakt nummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS understøttes også af en UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program fællesskab og med en DoD, Air Force Kontoret for Videnskabelig Forskning, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De synspunkter og konklusioner, der er indeholdt i dette dokument, er forfatternes og bør ikke fortolkes som repræsenterende officielt politikker, hverken udtrykkeligt eller stiltiende, af Defense Advanced Research Projects Agency eller den amerikanske regering.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Den endogene Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit udtryk her beskrevne system er en nem-at-run tre rør reaktion, som kan tage mindre end otte timer fra sat op til dataindsamling. Processen med at skabe alle reagenser kræver fem dages tid i alt (med betydelige behov for arbejdskraft på kun én dag), men producerer rå ekstrakt 3.000 reaktioner og buffer-making reagenser til 10.000 reaktioner (Figur 1). Desuden rå ekstrakt og buffer-making reagenser er stabile i mindst 1 år ved -80 ° C, der giver mulighed for flere anvendelser af et præparat. 4. På $ 0,11 per 10 ul reaktion ($ 0,26 herunder arbejdskraft), omkostningerne er 98% lavere end sammenlignelige kommercielle systemer (figur 2). Der er nogle uløste begrænsninger, men til systemet. Enden Effektiviteten af ​​de enkelte rå celle ekstrakt forberedelse kan variere baseret på brugerens færdighed og miljøforhold, selvom typiske udbytte variation er mellem 5-10% (figur 4b). Som et resultat, batch-til-batch variation i både endepunkt udtryk og i udtryk dynamik der må forventes. Disse variationer vil sandsynligvis forblive, indtil ekstrakt fuldt karakteriseret, eller indtil ekstrakt skabelse er fuldt automatiseret. Hvis det cellefrie ekspressionssystem anvendes til at udføre følsomme kvantitative forsøg, er det tilrådeligt at køre alle forsøg med den samme batch af rå celleekstrakt. Udbyttet fra en enkelt rå celle ekstrakt parti, omkring 3000 reaktioner, bør være tilstrækkelig til typiske eksperimentelle kurser. Selvom vi har mistanke om variation kan fjernes ved at skalere op og automatisere proceduren ville sådanne forsøg indebære en betydelig investering ressource. Derudover, selvom endepunkt ekspressionsniveauer rimeligt let at afgøre, der skal gøres i forståelse dynamik iboende til celle-fri system, mere arbejde. Det er kendt, at både ressource COMPETITIOn og ressource begrænsning kan påvirke udtryk dynamik. For eksempel kan begrænsede endogent sigma 70 resultere i en mættende regime med øget DNA-template producerer et udtryk nu analog med den i nukleotid-eller aminosyre udtynding. 9,27 imidlertid dynamik ikke behøver at være fuldt forstået at udnytte systemet. For rene stigninger i udbyttet, kan optimering ske ved maskine-learning tilgange. 28 spørgsmål om konkurrence og begrænsning ressource kan løses ved matematiske modeller kontrolleres ved hjælp af eksperimentelle data. Protokollen præsenteres her er optimeret til en BL21-Rosetta2 stamme, men er generaliseres til andre E. coli-stammer. Ændringer i BL21-Rosetta2, såsom fjernelse af det gen, der koder for lon protease og tilsætning af gener, der koder sjældne tRNA&#39;er, give mulighed for maksimal proteinproduktion. Vi har forsøgt protokollen med to andre ekstrakt stammer - kun BL21 og en BL21 trxA knockout-end fundet 50% mindre protein udbytte. Vi hypotesen, at udbyttet på samme måde falde, når du bruger andre stammer. Andre ændringer i parametre, såsom skift 2xYT vækstmediet for LB og andre rige bouillon, har resulteret i nedsat proteinudbytte. Cellefrie ekspressionssystemer udnytte både endogene og eksogene transkription-translation maskiner og reguleringsmekanismer har brede anvendelser i både protein og metabolit udtryk og i syntetisk biologi. 3,29 i stedet for at være begrænset til T7-regulerede kredsløb, kan man forestille sig at producere komplekse biomolekyler i et brugervenligt kontrollerbar indstilling ved hjælp af en blanding af indfødt E. coli promotorer og exogent tilførte transskription og reguleringsmekanismer. Uden begrænsninger af celledeling og stofskifte, kan variation i syntetiske kredsløb såsom repressilator eller metaboliske manipuleret veje såsom dem, der producerer artemisinin reduceres eller bedre forstået. 30,31 Vi have brugt disse fordele at implementere genetiske switche, samt at forstå sigma faktor binding 9,32 Sådan teknologi kan også danne rygraden i &quot;minimal&quot; eller &quot;kunstige&quot; celler -. lille, godt karakteriseres og selvforsynende indkapslinger enheder ekstrakt. 33,34 I sidste ende, vi forventer umiddelbare anvendelser af denne endogene celle-fri ekspressionssystem som prototyping miljø for syntetisk biologi. Tilnavnet &quot;TX-TL biomolekylære breadboard,&quot; celle-frie udtryk system giver en kontrollerbar miljø, hvor syntetiske kredsløb i sidste ende er bestemt til in vivo-ekspression kan undergå runder af prototyper - cykler test på grundlæggende plasmid, lineær eller kemisk syntetiseret DNA, efterfulgt ved analyse og hurtig modifikation. Prototyping runder kan blive hjulpet af prognosemodeller matematiske modeller ved at blive udviklet. Ved at fjerne kloning og in vivo manipulation for ikke-endelige kredsløb, forventer vi ingegeniørfirma cyklustider reduceres til 1-3 dage i stedet for de nuværende ugers standard.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Celle-ytringsfriheden teknologi begyndte i 1950&#39;erne som rent translationel, fremrykkende år senere til at omfatte koblet transkription-translationsmekanismer hjælp T7 bakteriofag DNA. 11,12 Siden da er der blevet gjort mange bestræbelser på at optimere skabelsen af rå celle ekstrakt (eller E coli. S30-ekstrakt). 13,14 Disse optimeringer omfatter forlænge celle-fri proteinsyntese ATP regenerering eller stamme ændringer igennem, og reducere protokol tid og omkostninger. findes 15-17 Alternative celle-frie udtryk, som bruger rekonstitueret komponenter i stedet for rå celle ekstrakt til udtryk. 5. Begge rå celle ekstrakt og rekonstituering metoder er blevet udviklet til kommerciel brug. Med fremkomsten af syntetisk biologi, er der et øget behov for en velkarakteriseret platform til at teste og udtrykke manipuleret biologiske moduler og kredsløb. 18,19 Denne platform skal værealsidig, godt karakteriseret, enkel at manipulere, og fokuserede på bruger-leverede komponenter. Trods at blive udviklet et halvt århundrede tidligere, cellefrie systemer baseret på E. coli uløseligt deler disse krav, da de er en forenklet in vitro fremstilling af cellulære processer uden kompleksiteten af vækst og metabolisme. Derudover alle de grundlæggende viden fra in vivo arbejde på E. coli gælder umiddelbart til E. coli cellefrie systemer. Selvom celle-fri ekspressionssystemer kan have applikationer i syntetisk biologi til dato målet for de fleste celle-fri ekspressionssystemer har været maksimering af protein og metabolit udbytte. Dette opnås ved anvendelse af T7-bakteriofag transskription af sekvenser drevet af T7 promotorer. 20. Selv om udtrykket er effektiv og robust disse systemer tjener et højt specialiseret formål. Cell reguleringsmetoder er begrænsede, skal mål-DNA skabeloner værereengineered at omfatte T7 initiativtagere, og visse sekvenser, såsom ribosomale komplekser kan ikke transkriberet og samles. 21,22 Eksisterende celle-fri ekspressionssystemer er i stand til at opretholde høje udbytter, mens endogene reguleringsmekanismer, en alsidighed er nødvendig for syntetisk biologi bevare. Vi har udviklet en endogen E. coli celle-frie udtryk, der bevarer effektiviteten af protein udtryk demonstreret ved tidligere systemer, men tilføjer yderligere alsidighed ved at tillade ekspression og regulering baseret på både endogene og eksogene (T7 eller andre) mekanismer. Den her beskrevne protokol er oprindeligt baseret på Kigawa et al. (2004) og Liu et al. (2005), men har væsentlige ændringer. Det udnytter Mg-og K-glutamat i Mg-og K-acetat for øget effektivitet, fjerner 2-mercaptoethanol, og lyserer celler under anvendelse af en perle-piskeris. 17,23,24 Perle-bankende er valgt frem homogeniseringtrykbaserede metoder eller lydbehandling på grund af sin lavere omkostninger og sammenlignelige udbytter til konkurrerende systemer. 23. 3-phosphoglyceric-(3-PGA) anvendes som energikilde da det blev fundet at give overlegen proteinudbytter forhold til creatinphosphat og phosphoenolpyruvat. 4,25 Vores system kan producere op til 0,75 mg / ml reporter protein under anvendelse af enten en sigma70 baseret promotor med lambda-fag-operatører eller en T7-drevet promotor, svarende til udbyttet fra andre kommercielle systemer. 4,6 Fem dage er forpligtet til at producere alle nødvendige reagenser (Figur 1). Desuden giver en reduktion 98% af omkostningerne i forhold til sammenlignelige kommercielle celle-fri systemer - materialeomkostninger er $ 0,11 per 10 ul reaktion, der stiger til $ 0,26 med arbejdskraft inkluderet (figur 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Ideelle cellefrie ekspressionssystemer kan teoretisk efterligne en in vivo cellulære miljø i et kontrolleret in vitro platform. 1. Dette er nyttigt til ekspression af proteiner og genetiske kredsløb på en kontrolleret måde, samt til at tilvejebringe en prototyping miljø for syntetisk biologi. 2,3 For at nå sidstnævnte mål, celle-fri ekspressionssystemer der bevarer endogene Escherichia coli transskription-oversættelse mekanismer er i stand til mere præcist afspejler in vivo cellulære dynamik end dem baseret på T7 RNA-polymerase transkription. Vi beskriver forberedelsen og gennemførelsen af en effektiv endogent E. coli baseret transkription-translation (TX-TL) celle-frie udtryk, der kan producere tilsvarende mængder af protein som T7-baserede systemer til en omkostningsreduktion 98% til tilsvarende kommercielle systemer. 4,5 Udarbejdelsen af buffere og rå celle-ekstrakt er beskrevet, samt udførelsen af ​​entre rør TX-TL-reaktion. Hele protokol tager fem dage til at forberede og giver nok materiale til op til 3000 enkelt reaktioner i et præparat. Når forberedt, hver reaktion tager under 8 timer fra setup til indsamling og analyse af data. Reguleringsmekanismer og transskription eksogene til E. coli, såsom lac / tet repressorer og T7-RNA-polymerase, kan suppleres. 6 Endogene egenskaber, såsom mRNA og DNA nedbrydningshastigheder kan også justeres. 7 TX-TL cellefrit ekspressionssystem er blevet demonstreret i stor skala kredsløb samling, udforske biologiske fænomener, og ekspression af proteiner under både T7-og endogene promotorer. 6,8 Ledsageforanstaltninger matematiske modeller er til rådighed. 9,10 Den resulterende system har unikke applikationer i syntetisk biologi som en prototyping miljø eller &quot;TX- TL biomolekylære breadboard. &quot;

Vi har præsenteret en fem dages protokol for udarbejdelsen af et endogent Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit ekspressionssystem. En prøve tidslinje for at skabe de reagenser - rå celle ekstrakt og buffer - kan findes i figur 1. Når den er oprettet, kan disse opbevares ved -80 ° C i op til et år. Efter reagenser er oprettet, kan forsøgsopstilling og udførelse ske på mindre end 8 timer. Derudover har vi optimeret betingelserne for TX-TL cellefrit ekspressionssystem udtryk. Andre bruger-leverede tilføjelser, såsom buffere eller DNA-løsninger, bør kalibreres for toksicitet forhånd. For eksempel skal forskellige metoder til behandling af plasmider resulterer i andet udtryk grund saltindhold. Vi har også testet effekten af Tris-CI elueringspuffer på reaktionen effektivitet (figur 5). Et eksempel på rå celleekstrakt kalibrering henvisning trin 4,1-4,9, er visti figur 4a. Generelt vores forsøg viser, at det rå celleekstrakt er mest følsomt over for Mg-glutamatniveauer, efterfulgt af K-glutamat niveauer. For at demonstrere den celle-fri ekspressionssystem, vi konstrueret og afprøvet en negativ feedback loop baseret på tet undertrykkelse. 26 (figur 6). I cellen-ytringsfriheden system, samme kreds løb med og uden ATC viser en 7-fold endepunkt udtryk ændring af deGFP reporter efter otte timers udtryk. Selvom dette eksperiment ikke kræver globale inducere eller repressorer, hvis det er nødvendigt de kan tilføjes under &quot;Master Mix Forberedelse.&quot; <img alt="Figur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figur 1. Tidslinje for rå celle-ekstrakt, aminosyre løsning, og energiløsning forberedelse. En fem-dages timelin<html> e for en typisk udførelse af protokollen er givet ovenfor, er optimeret til overnattende inkubationer og dagtimerne arbejdstrin. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figur 2. Omkostninger og udtryk analyse af konkurrerende rå celleekstrakter. a) Fordeling af omkostningerne til arbejdskraft og materialer af TX-TL cellefrit ekspressionssystem. Baseret på omkostninger af reagenser fra december 2012, og lønomkostninger på $ 14 per time. B) Sammenligning af TX-TL celle-fri udtryk system omkostninger vs andre kommercielle systemer. Omkostningerne er opdelt pr ul, selvom reaktionsvolumener kan variere per sæt. C) Sammenligning af TX-TL cellefrit ekspressionssystem udbytte vs andre kommercielle systemer. Proteinekspression udbytte bestemt ved producentens standarder./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større figur. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figur 3. Lastning og forarbejdning af en perle-bankende rør. a) Påvisning af korrekt viskositet på celle-kugle-løsning. Cell-perle løsning vil have en viskositet afhænger af mange faktorer, herunder mængden af S30A til ITU buffer tilsættes, mængden af perler tilføjet, og tid brugt på is. B) Loading af perle-slå rør før hurtig bordplade centrifugering. Den centrifugering fjerner bobler akkumuleret under lastning. C), bobler belægning efter bordplade centrifugering. Størrelsen af boblerne vil variere, de kan poppet eller fjernes ved hjælp af en pipettespids d) Helt fyldte perle-slå rør uden reduktion.. En menisk dannes i perle-slå tUbe, og hætten har nok til at dække og forårsage små mængder at overfylde. e) Korrekt indlæst filter apparater. Disse kan genbruges. F) Sammenligning af korrekt vs forkert forarbejdet perle-slå rør. Røret til venstre er et godt slag rør - det er udstyret med en lille og godt afgrænset øverste lag, og meget klar supernatant. Røret til højre er suboptimale baseret på de større, tåget andet lag og uklar supernatant. Rør, der suboptimal bør ikke undergår yderligere behandling. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figur 4.. Egenskaber af rå ekstrakt præparater. a) Typiske kalibrering grunde til rå celle ekstrakt. Råekstrakt er kalibreret til yderligere Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT-niveauer, i den rækkefølge. Vist er endpoint fluorescence efter 8 timer, samt maksimal hastighed af protein produktion baseret på en 12 minutters glidende gennemsnit. Baseret på disse grunde, et acceptabelt område af yderligere Mg-glutamat er 4 mM K-glutamat er 60-80 mM og DTT er 0-3 mM. Bemærk, at hver råekstrakt skal kalibreres uafhængigt for disse tre variabler. B) Ændring fra ekstrakt præparater. Endpoint fluorescens af to råekstrakter udarbejdet på forskellige datoer vises, fejlsøjler er 1 standardafvigelse fra tre uafhængige kørsler på forskellige dage. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figur 5. Virkninger af DNA-opløsning på ekspression effektivitet. a) Sammenligning af to forskellige rensningmetoder til behandling af plasmider. 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 er udarbejdet ved hjælp af kun en QIAprep Spin Miniprep Kit (Oprensning metode 1) eller efterbehandlet med en QiaQuick PCR oprensning kit (Oprensning metode 2). Vist er endpoint fluorescens efter 8 timer, samt maksimal hastighed af protein produktion baseret på en 12 minutters glidende gennemsnit. Fejllinjer er 1 standardafvigelse fra fire uafhængige kørsler på forskellige dage. B) Effekt af elueringsbuffer (Tris-Cl). Forskellige koncentrationer af Tris-CI sammenlignes i en cellefri ekspression reaktion baseret på ekspressionen af ​​1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Fusioner er endelige koncentrationer af Tris-CI i reaktionens elueringsbuffer anvendes er 10 mM Tris-CI. Fejllinjer er 1 standardafvigelse fra tre uafhængige kørsler på forskellige dage. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-side = &quot;altid&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figur 6. Sample TX-TL kørsel af en negativ feedback-sløjfe. a) Prøve opsætning af et cellefrit udførelse reaktion. Tests &quot;på&quot; versus &quot;off&quot; tilstand af den negative feedback loop, med positive og negative kontroller. B) Plasmid kort af negativ feedback-sløjfe. C) Repræsentative resultater. Data afspejler eksperiment i a) og b), med negativ kontrol subtraheret fra signalet. Genetisk kredsløb vist i indsatsen. Fejllinjer er 1 standardafvigelse fra tre uafhængige kørsler på forskellige dage. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Koncentration </td><td> Beløb </td><td> Sterilisation </td><td> Noter </td></tr><tr><td> Chloramphenicol (CM) </td><td> 34 mg / ml i ethanol </td><td> 1 ml </td><td> Filtersteriliser (0,22 uM) </td><td> Kan fremstilles i større mængder, der er lagret ved -20 ° C til senere brug. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm agarplade </td><td> 31 g / L 2 x YT, 40 mM dibasisk kaliumphosphat, 22 mM monobasisk kaliumphosphat, 34 ug / ml chloramphenicol </td><td> 1 plade </td><td> Autoklave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P medier </td><td> 31 g / L 2 x YT, 40 mM dibasisk kaliumphosphat, 22 mM monobasisk kaliumphosphat </td><td> 4 L </td><td> Autoklave </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagenser til dag 1 i Rå Cell Extract-protokollen. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Koncentration </strong&gt; </td><td> Beløb </td><td> Sterilisation </td><td> Noter </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filtersteriliser (0,22 uM) eller autoklav </td><td> Kan opbevares ved stuetemperatur. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filtersteriliser (0,22 uM) </td><td> Kan fremstilles i større mængder og opbevaret ved -20 ° C til senere brug. </td></tr><tr><td> S30A til ITU buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoklave </td><td> For at nå pH 7,7, titreres med eddikesyre. Læg DTT til 2 mM slutkoncentration lige før brug. Opbevares ved 4 ° C. </td></tr><tr><td> S30B buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoklave </td><td> For at nå pH 8,2, titreres med 2MTris. Læg DTT til 1 mM slutkoncentration lige før brug. Opbevares ved 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reagenser til dag 2 i Rå Cell Extract-protokollen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falcon </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4. </td></tr><tr><td> Tomme 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon med pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellet masse (50 ml Falcon med pellet - tom 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A til ITU buffervolumen tilføje (pellet masse * 0,9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Samlet masse af perler til at tilføje (pellet masse * 5,0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. S30A til ITU buffer og perlemassen regnemaskine til dag 3 i Rå Cell Extract protokol. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Koncentration </td><td> Beløb </td><td> Sterilisation </td><td> Noter </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Ingen </td><td> For at nå pH 8, titreres med KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP og GTP, 94 mM CTP og UTP, pH 7,5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Ingen </td><td> For at nå pH 7,5, titreres med KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 pi </td><td> Ingen </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mm </td><td> 600 pi </td><td> Ingen </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 pi </td><td> Ingen </td><td> For at nå pH 7,5-8, titreres med Tris ved 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 pi </td><td> Ingen </td><td> For at nå pH 8, titreres med Tris ved 2 M. </td></tr><tr><td> Folsyre </td><td> 33.9 mM </td><td> 300 pi </td><td> Ingen </td><td> Selvom der er behov for kun 300 ul, opskrift i supplerende er 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> 1 M </td><td> 150 pi </td><td> Ingen </td><td> Opbevares ved 4 ° C, opvarmes til 37 ° C for at smelte. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Ingen </td><td> For at nå pH 7,5, titreres med Tris ved 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Reagenser at forberede Energy Solution protokollen. Supplerende Materiale 1. Opskrifter til poster. Chloramphenicol, 34 mg / ml: Forbered 0,51 g chloramphenicol og tilføje ethanol til 15 ml. Filtersteriliser (0,22 uM), alikvot til 1 ml rør, opbevares ved -20 ° C til senere brug. 2xYT + P + Cm agarplade: Forbered 1,24 g 2xYT, 1,6 ml dibasisk kaliumphosphat opløsning @ 1 M, 0,88 ml monobasisk kaliumphosphat opløsning @ 1 M, 0,6 g agar og vand til 40 ml. Autoklav. Lad afkøle til 50 ° C og tilsættes 40 ul Cm. Alikvot 25 ml i en 100 x 15 mm petriskål, og lad afkøle i en time. 2xYT + P medier: Forbered 124 g 2xYT, 160 ml kalium dibasisk løsning @ 1 M, 88 ml kalium monobasisk løsning @ 1 M, og vand til 4 L. Aliquot ud i 2 x 1,88 L og 0,24 L. Autoklave. Tris-base, 2 M: Forbered 60,57 g Tris-base og vand til 250 ml. Sterilisere, opbevares ved stuetemperatur til senere brug. DTT, 1 M: Forbered 2,31 g DTT og vand til 15 ml. Filtersteriliser (0,22 uM), alikvot til 1 ml rør, opbevares ved -20 ° C til senere brug. S30A til ITU buffer: Forbered 10.88 g Mg-glutamat og 24.39 g K-glutamat, 50 ml Tris på 2M, eddikesyre (til pH 7,7) og vand til 2 L. Autoklave, opbevares ved 4 ° C, tilsættes 4 ml 1 M DTT før brug. S30B buffer: Forbered 10.88 g Mg-glutamat og 24.39 g K-glutamat, Tris ved 2 M (til pH 8,2) og vand til 2 L. Autoklave, opbevares ved 4 ° C, tilsættes 2 ml 1 M DTT før brug. HEPES: Forbered 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (til pH 8) og vand til 4 ml. tRNA: Forbered 30 mg tRNA og vand til 600 ul. CoA: Forbered 30 mg CoA (MW 767,53) og vand til 600 ul. NAD: Læg 34,83 ​​mg NAD (MW 663,43), Tris ved 2 M (pH 7,5-8) og vand til 300 pi. (Tilføj 27 pi Tris ved 2 M for at bringe opløsningen til pH 7,5-8). cAMP Læg 42,80 mg af cAMP (MW 329,22), Tris ved 2 M (til pH 8) og vand til 200 pi. (Tilføj 73 pi Tris ved 2 M for at bringe opløsningen til pH 8). Folinsyre (33,9 mm): 20 mg fast folininsyre calcium salt (MW 511,5), der tilsættes 1,15 ml vand. Spermidin: Forbered 23,55 pi spermidin (MW 145.25) og vand til 150 ul. Forbered ved stuetemperatur efter smeltning kortvarigt ved 37 ° C. 3-PGA: Tilføj 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris ved 2 M (til pH 7,5) og vand til 3,2 ml. (Tilføj 1,73 ml Tris ved 2 M for at bringe opløsningen til pH 7,5). Nucleotide Mix: Tilføj 145 mg ATP dikaliumsalt dihydrat (MW 619,4), 133 mg GTP dinatriumsalt (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumsaltdihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumsalt dihydrat (MW 586,12) , KOH ved 15% fortynding (til pH 7,5) og vand til 1,5 ml. (Tilføj 353 pi KOH ved 15% fortynding for at bringe opløsningen til pH 7,5). Supplerende materiale 2. Bradford-analysen. <ol><li> Fjern Bradford middel fra 4 ° C og opbevares ved stuetemperatur. </li><li> Forbered 50 pi BSA standard ved 1 mg / ml og 0,1 mg / ml. </li><li> Forbered 40 pi 20x fortynding af ekstrakt fra trin 1.47. </li><li> Tilføj 800 pi vand til 7 kuvetter. </li><li> Forbered faste kuvetter til 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 pi 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 pi 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 pi 1 mg / ml BSA) 6 mg / ml (6 pi 1 mg / ml BSA). </li><li> Forbered eksperimentelle kuvetter til 2 pi prøve og 4 pi af prøven. </li><li> Tilsæt 200 ul Bradford agent til hver kuvette og bland godt by pipettering. Der inkuberes ved stuetemperatur i mindst 10 min. </li><li> Fremstil standardkurve ved OD 595 nm ved anvendelse af kuvetter fra trin 6.5. Afvis standardkurve hvis r 2 &lt;0,95. </li><li> Bestem ekstrakt koncentration ved OD 595 nm ved brug af kuvetter fra trin 6.6. </li></ol> Supplerende materiale 3. Buffer kalibrering regneark. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Se TXTL_e (skabelon) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Supplerende materiale 4. Celle-ytringsfriheden køre regneark. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Se TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Denne fem-dages-protokollen skitserer alle trin, udstyr og supplerende software er nødvendig for at skabe og drive en effektiv endogent Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit udtryk system fra bunden. Med reagenser, protokollen tager 8 timer eller mindre til opsætning af en reaktions, indsamle og behandle data.

Protokollerne til gennemførelse af en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baseret TX-TL Cell-Free Expression System for syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Hurtig Protokol for Udarbejdelse af elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Den mangesidede Fordele ved Protein Co-ekspression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Baseret Cell ytringsfrihed Systemer til ekspression af<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Rest-specifikke Inkorporering af Noncanonical Aminosyrer i Model Proteiner Brug en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cellefri transskription-translationssystem