Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Wij danken Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, en Enoch Yeung voor hulp stroomlijnen het protocol, en Clare Chen en Barclay Lee voor hulp in de vroege stadia van het project. Dit materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Gieterijen programma, contractnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS wordt ook ondersteund door een UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program gemeenschap en door een DoD, luchtmacht van het Wetenschappelijk Onderzoek, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De standpunten en conclusies in dit document zijn die van de auteurs en dient niet te worden geïnterpreteerd als officieel beleid, noch uitdrukkelijk noch impliciet, van de Defense Advanced Research Projects Agency of de Amerikaanse regering.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem hier beschreven is een makkelijk-to-run drie buis reactie die minder dan acht uur kan nemen van het opzetten van de verzameling van gegevens. Het proces waarbij alle reagentia vereist vijf dagen tijd totaal (met aanzienlijke arbeid eisen slechts een dag), maar levert ruw extract 3000 reacties en buffer-making reagentia 10.000 reacties (figuur 1). Bovendien, ruw extract en buffer-making reagentia zijn stabiel gedurende tenminste 1 jaar bij -80 ° C, waardoor meervoudig gebruik van een preparaat. 4 Op $ 0,11 per 10 ul reactie ($ 0,26 inclusief arbeid), de kosten zijn 98% lager dan bij vergelijkbare commerciële systemen (figuur 2). Er zijn een aantal onopgeloste beperkingen, echter het systeem. Het einde efficiëntie van elke ruwe celextract voorbereiding kan variëren op basis van de gebruiker vaardigheid en op milieu-omstandigheden, hoewel typical opbrengst variatie is tussen 5-10% (figuur 4b). Hierdoor partij tot partij variabiliteit in zowel eindpunt expressie en expressie dynamiek te verwachten. Deze variaties zullen waarschijnlijk blijven totdat extract volledig is gekarakteriseerd of totdat extract creatie volledig geautomatiseerd. Als het celvrije expressiesysteem wordt gebruikt om gevoelige kwantitatieve experimenten, is het raadzaam om alle experimenten uitgevoerd met dezelfde partij ruw celextract. De opbrengst van een enkele ruwe celextract partij, ongeveer 3000 reacties, zou voldoende moeten zijn voor typische experimentele cursussen. Hoewel we vermoeden variatie kan worden verwijderd door schaalvergroting en automatiseren van de procedure, zou deze pogingen aanzienlijke investering bron te betrekken. Bovendien, hoewel eindpunt expressie niveaus zijn redelijk eenvoudig te bepalen, moet meer werk worden gedaan in het begrijpen dynamiek inherent aan de cel-vrij systeem. Het is bekend dat beide middelen competition en resource beperking kan invloed hebben op de expressie dynamiek. Zo kan beperkt endogene sigma 70 resulteren in een verzadigende regime verhoogde DNA-matrijs vervaardigen van een expressieprofiel analoog aan die van nucleotide of aminozuur uitputting. 9,27 echter dynamiek niet volledig te worden verstaan ​​het systeem gebruiken. Voor pure stijgingen van de opbrengst, kan optimalisatie worden gedaan door machine-learning benaderingen. 28 Vragen van de concurrentie hulpbronnen en beperking kan worden aangepakt door wiskundige modellen geverifieerd met behulp van experimentele gegevens. De hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor een BL21-Rosetta2 stam, maar generalizable andere E. coli-stammen. Wijzigingen in BL21-Rosetta2, zoals het verwijderen van het gen dat codeert lon protease en de toevoeging van genen die coderen voor zeldzame tRNA, zorgen voor maximale eiwitproductie. We hebben het protocol geprobeerd met twee andere extract stammen - alleen BL21 en BL21 een trxA knockout-eend hebben 50% minder eiwit opbrengst. Onze hypothese is dat de rendementen op dezelfde afnemen bij het gebruik van andere stammen. Andere veranderingen in parameters, zoals het wisselen 2xYT groeimedium voor LB en andere rijke bouillon, hebben geresulteerd in verminderde eiwitrendement. Cel-vrije expressie systemen met gebruik van zowel endogene en exogene transcriptie-translatie machines en mechanismen regelgeving hebben brede toepassingen in zowel eiwitten en metabolieten expressie en in de synthetische biologie. 3,29 In plaats van beperkt te zijn tot-T7 gereguleerd circuits, kan men voor ogen produceren van complexe biomoleculen in een door de gebruiker regelbare instelling met een mix van inheemse E. coli promotors en exogeen geleverd transcriptie en regelmechanismen. Zonder beperkingen van celdeling en metabolisme, kan variabiliteit in synthetische circuits zoals de repressilator of metabole gemanipuleerde lichaam zoals het produceren van artemisinine worden verminderd of beter begrepen. 30,31 Wij have gebruikt deze voordelen uit te voeren genetische schakelaars, alsmede sigmafactor vastlegging begrijpen 9,32 Deze technologie kan ook de ruggengraat van &quot;minimal&quot; of &quot;kunstmatige&quot; cellen -. klein, goed gekarakteriseerd en zelfvoorzienend belichaamde eenheden van extract. 33,34 Uiteindelijk verwachten we onmiddellijk gebruik van deze endogene cel vrije expressie systeem als een prototyping omgeving voor synthetische biologie. Bijnaam &quot;TX-TL biomoleculaire breadboard,&quot; het celvrije expressiesysteem verschaft een controleerbare omgeving waar synthetische circuits die bestemd is voor in vivo expressie kunnen golf prototyping ondergaan - cycli van proeven op basis plasmide lineair of chemisch gesynthetiseerd DNA, gevolgd van analyse en snelle modificatie. Prototyping rondes kunnen worden geholpen door voorspellende wiskundige modellen die momenteel worden ontwikkeld. Door het verwijderen van klonen en in vivo manipulatie voor niet-finale circuits, verwachten we engiengineering cyclustijden te verlagen tot 1-3 dagen in plaats van de huidige weken standaard.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Celvrije expressie technologie begon in de jaren 1950 als puur translationeel, het vorderen der jaren later aan gekoppelde transcriptie-translatie mechanismen omvatten het gebruik van T7 bacteriofaag DNA. 11,12 Sindsdien hebben talrijke inspanningen werden geleverd om de creatie van ruwe cel-extract (of E optimaliseren . coli S30 extract). 13,14 Deze optimalisaties omvatten het verlengen van celvrije eiwitsynthese door ATP regeneratie of stam wijzigingen, en het verminderen van het protocol tijd en kosten. 15-17 Alternative-cel vrije expressie systemen bestaan ​​die gebruik bereide componenten in plaats van ruwe celextract voor expressie. 5 Beide ruw celextract en reconstitutie methoden ontwikkeld voor commercieel gebruik. Met de komst van de synthetische biologie, is er een verhoogde behoefte aan een goed gekarakteriseerd platform te testen en uit te drukken gemanipuleerde biologische modules en circuits. 18,19 Dit platform moetveelzijdig, goed gekarakteriseerde, eenvoudig te manipuleren, en gericht op de gebruiker geleverde componenten. Ondanks dat een halve eeuw geleden ontwikkeld celvrije systemen op basis van E. coli intrinsiek deel deze eisen, omdat ze een vereenvoudigde weergave van in vitro cellulaire processen waarbij de complexiteit van de groei en metabolisme. Daarnaast zijn alle van de fundamentele kennis van in-vivo werk op E. coli toepassing gemakkelijk E. coli celvrije systemen. Hoewel cel vrije expressie systemen toepassingen kunnen hebben in de synthetische biologie, om het doel van de meeste cel-vrije meningsuiting systemen op heden heeft de maximalisatie van eiwitten en metabolieten opbrengst geweest. Dit wordt bereikt door gebruik bacteriofaag T7 transcriptie van sequenties aangedreven door T7 promoters. 20 Hoewel expressie efficiënte en robuuste Deze systemen dienen een gespecialiseerde doel. Celregulering methoden zijn beperkt, moet doelwit DNA templates zijnreengineered naar T7 promotors omvatten, en bepaalde sequenties zoals ribosomale complexen kan niet worden getranscribeerd en gemonteerd. 21,22 Bestaande celvrije expressie systemen in staat zijn om hoge opbrengsten te behouden met behoud van endogene regulerende mechanismen, een veelzijdigheid die nodig is voor de synthetische biologie. We hebben een endogene E. ontwikkeld coli celvrij expressiesysteem dat de efficiëntie van eiwitexpressie blijkt uit eerdere systemen behouden maar voegt extra veelzijdigheid doordat expressie en regulering gebaseerd op zowel endogene en exogene (T7 of andere) mechanismen. De hier beschreven protocol is gebaseerd op mijn Kigawa et al.. (2004) en Liu et al.. (2005), maar heeft belangrijke wijzigingen. Het maakt gebruik van Mg-en K-glutamaat op Mg-en K-acetaat voor een hogere efficiëntie, verwijdert 2-mercapto-ethanol, en lyseert cellen met behulp van een kraal-beater. 17,23,24 Bead-beating wordt verkozen boven homogenisering,-druk-gebaseerde methoden, of sonicatie vanwege de lagere kosten en vergelijkbare opbrengsten aan concurrerende systemen. is 23 3-fosfoglycerinezuur (3-PGA) gebruikt als energiebron zoals het werd gevonden om superieure eiwitopbrengsten geven in vergelijking met creatine fosfaat en fosfoenolpyruvaat. 4,25 Ons systeem kan produceren tot 0,75 mg / ml reporter eiwit met behulp van een-sigma70 gebaseerde promotor met lambda-faag exploitanten of een-T7 gedreven promotor, vergelijkbaar met de opbrengst van andere commerciële systemen. 4,6 Vijf dagen zijn verplicht om alle benodigde reagentia (figuur 1) te produceren. Bovendien biedt het een 98% kostenbesparing ten opzichte van vergelijkbare commerciële cel-vrije systemen - materiële kosten zijn $ 0,11 per 10 ul reactie, die stijgt tot $ 0,26 met inclusief arbeidsloon (figuur 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Ideaal celvrije expressiesystemen kan theoretisch emuleren een in vivo cellulaire omgeving in een gecontroleerde in vitro platform. 1 Dit is nuttig om eiwitten en genetische circuits op een gecontroleerde wijze en voor het verschaffen van een omgeving voor prototyping synthetische biologie. 2,3 Om dit laatste doel te bereiken, cel-vrije expressie systemen die behouden endogene Escherichia coli transcriptie-translatie mechanismen zijn in staat om een betere weerspiegeling van in vivo cellulaire dynamiek dan op basis van T7 RNA polymerase transcriptie. We beschrijven de voorbereiding en uitvoering van een efficiënt endogene E. coli gebaseerde transcriptie-translatie (TX-TL)-cel-vrije expressie systeem dat equivalente hoeveelheden eiwit als T7-gebaseerde systemen kunnen produceren tegen een 98% kostenreductie soortgelijke commerciële systemen. 4,5 De bereiding van buffers en ruwe cel extract zijn beschreven, evenals de uitvoering van eendrie buis TX-TL reactie. Het gehele protocol duurt vijf dagen voor te bereiden en levert genoeg materiaal voor maximaal 3000 enkele reacties in een voorbereiding. Eenmaal opgesteld, elke reactie is onder de 8 uur van installatie tot het verzamelen en analyseren van gegevens. Mechanismen van regulering en transcriptie exogeen E. coli, zoals lac / tet onderdrukkers en T7 RNA polymerase kan worden aangevuld. 6 Endogene eigenschappen, zoals mRNA en DNA afbraaksnelheden, kan worden aangepast. 7 De TX-TL celvrij expressiesysteem is aangetoond voor zware schaal circuit assemblage, het verkennen van biologische verschijnselen, en de expressie van eiwitten onder zowel T7-en endogene promotors. 6,8 Begeleidende wiskundige modellen zijn beschikbaar. 9,10 Het resulterende systeem heeft unieke toepassingen in de synthetische biologie als een prototyping omgeving, of &quot;TX- TL biomoleculaire breadboard. &quot;

We hebben een vijfdaagse protocol gepresenteerd voor de bereiding van een endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem. Een monster tijdlijn voor het creëren van de reagentia - ruwe cel-extract en buffer - is te vinden in figuur 1. Eens gemaakt, kan deze worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar. Na reagentia zijn gemaakt, kunt experimentele opstelling en de uitvoering worden gedaan in minder dan 8 uur. Daarnaast hebben we geoptimaliseerd expressieomstandigheden van de TX-TL celvrij expressiesysteem. Andere gebruiker geleverde toevoegingen, zoals buffers of DNA oplossingen wordt gekalibreerd toxiciteit vooraf. Bijvoorbeeld, verschillende verwerkingsmethoden van plasmiden leiden tot verschillende expressie door zoutgehalte. We testten ook het effect van Tris-Cl elutiebuffer bij reactie-efficiëntie (Figuur 5). Een voorbeeld van ruw celextract kalibratie verwijzing stap 4,1-4,9, weergegevenin figuur 4a. In het algemeen onze experimenten blijkt dat het ruwe celextract is het meest gevoelig voor Mg-glutamaat, gevolgd door K-glutamaat. De celvrije expressiesysteem tonen, construeerden wij en getest tegenkoppellus basis van tet repressie. 26 (figuur 6). In de cel-vrije expressie systeem, hetzelfde circuit run met en zonder ATC toont een 7-voudig eindpunt expressie verandering van deGFP reporter na acht uur van meningsuiting. Hoewel dit experiment geen wereldwijde inductoren of repressors vereisen, indien nodig zij onder &quot;Master Mix Voorbereiding.&quot; Kan worden toegevoegd <img alt="Figuur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figuur 1. Tijdlijn voor ruwe cel extract, aminozuur oplossing, en energie oplossing voorbereiding. Een vijfdaagse Timelin<html> e voor een typische uitvoering van het protocol is hierboven gegeven, geoptimaliseerd voor overnachting incubatie en overdag werken stappen. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figuur 2. Kosten en expressie analyse van concurrerende ruwe cel extracten. a) Verdeling van de kosten van arbeid en materialen van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem. Gebaseerd op de kosten van reagentia als van december 2012, en de arbeidskosten van $ 14 per uur. B) Vergelijking van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem kosten versus andere commerciële systemen. De kosten worden uitgesplitst per pi, hoewel reactie volumes per kit. C) Vergelijking van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem rendement versus andere commerciële systemen kan variëren. Eiwitexpressie het rendement bepaald door de fabrikant normen./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figuur 3. Laden en verwerking van een kraal-beating buis. a) Demonstratie van de juiste viscositeit van cel-kraal oplossing. Cel-kraal oplossing zal een viscositeit afhankelijk van vele factoren, inclusief het bedrag van S30A buffer toegevoegd, de hoeveelheid kralen toegevoegd, en tijd besteed aan ijs te hebben. B) Laden van-kraal verslaan buis voor snel tafelblad centrifugeren. Het centrifugeren verwijdert belletjes opgedaan tijdens het laden. C) Bubbles oppervlakte komt na tafelblad centrifugeren. De grootte van de belletjes zal variëren, ze kunnen worden geknald of verwijderd met behulp van een pipet tip d) Volledig ingevuld kraal verslaan buis voor het afdekken.. Een meniscus wordt gevormd in de kraal slaan tube, en de dop heeft genoeg te dekken en veroorzaken kleine hoeveelheden niet te vol raakt. e) Correct geladen filterapparaat. Deze kunnen worden hergebruikt. F) Vergelijking kunnen tegen verkeerd bewerkte kraal slaan buis. De buis aan de linkerkant is een goed ritme tube - het heeft een klein en goed afgebakend toplaag, en zeer heldere bovenstaande. De buis rechts niet optimaal zijn, gebaseerd op de grotere, wazige tweede laag en de wazige supernatant. Buizen die suboptimaal zijn moeten extra bewerking ondergaan. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figuur 4. Eigenschappen van ruw extract preparaten. a) Typische kalibratie percelen voor ruwe cel extract. Ruw extract wordt gekalibreerd voor extra Mg-glutamaat, K-glutamaat, en DTT niveau, in die volgorde. Getoond wordt eindpunt fluorescence na 8 uur, en maximale percentage van eiwitproductie op basis van een 12 minuten voortschrijdend gemiddelde. Op basis van deze percelen een acceptabel bereik aanvullende Mg-glutamaat 4 mM K-glutamaat 60-80 mM DTT en 0-3 mM. Merk op dat elke ruwe extract moet onafhankelijk voor deze drie variabelen worden gekalibreerd. B) Variatie van extract preparaten. Endpoint fluorescentie van twee ruwe extracten voorbereid op verschillende data wordt getoond; fout bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figuur 5. Effecten van DNA-oplossing op de expressie-efficiëntie. a) Vergelijking van twee verschillende zuiveringwerkwijzen voor de verwerking plasmiden. 1 nM van pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 wordt bereid met behulp van slechts een Qiaprep Spin Miniprep Kit (Zuivering methode 1) of nabewerkt met een QiaQuick PCR zuivering kit (Zuivering methode 2). Getoond wordt eindpunt fluorescentie na 8 uur, en maximale snelheid van eiwitproductie op basis van een 12 minuten gemiddelde. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van vier onafhankelijke runs op verschillende dagen. B) Effect van elutiebuffer (Tris-Cl). Verschillende concentraties van Tris-Cl worden vergeleken in een celvrije expressie reactie gebaseerd op de expressie van 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Concentraties gelden eindconcentraties Tris-Cl in de reactie; elutiebuffer gebruikte 10 mM Tris-Cl. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <p class="jove_content" fo:houden-together.within-page = &quot;altijd&quot;&gt; <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figuur 6. Sample TX-TL run van een negatieve feedback loop. a) Steekproef setup van een cel-vrije uitvoering reactie. Tests &quot;op&quot; vs &quot;uit&quot; staat van de negatieve feedback loop, met positieve en negatieve controles. B) Plasmidemap van negatieve terugkoppeling. C) Representatieve resultaten. Gegevens weerspiegelt experiment in a) en b), met negatieve controle afgetrokken van signaal. Genetische circuit getoond in insert. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Concentratie </td><td> Bedrag </td><td> Sterilisatie </td><td> Notes </td></tr><tr><td> Chlooramfenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml in ethanol </td><td> 1 ml </td><td> Filter steriliseren (0,22 pm) </td><td> Kunnen worden gemaakt in grotere hoeveelheden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm agar plaat </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM dibasisch kaliumfosfaat, 22 mM kaliumfosfaat monobasisch, 34 ug / ml chlooramfenicol </td><td> 1 plaat </td><td> Autoclaaf </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P media </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM dibasisch kaliumfosfaat, 22 mM kaliumfosfaat monobasisch </td><td> 4 L </td><td> Autoclaaf </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia voor dag 1 van Ruwe Cell Extract protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Concentratie </strong&gt; </td><td> Bedrag </td><td> Sterilisatie </td><td> Notes </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filter steriliseren (0,22 pm) of autoclaaf </td><td> Kan worden bewaard bij kamertemperatuur. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filter steriliseren (0,22 pm) </td><td> Kunnen worden in grotere hoeveelheden en opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. </td></tr><tr><td> S30A buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoclaaf </td><td> PH 7,7 te bereiken, titreer met azijnzuur. Voeg DTT tot 2 mM uiteindelijke concentratie vlak voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> S30B buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclaaf </td><td> Tot pH 8,2 te bereiken, titreer met 2MTris. Voeg DTT tot 1 mM uiteindelijke concentratie vlak voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reagentia voor dag 2 van ruwe Cell Extract protocol. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Valk </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Lege 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon met pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellet massa (50 ml Falcon met pellet - lege 50 ml Falcon) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A buffer volume toe te voegen (pellet massa * 0,9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Totale massa van kralen te voegen (pellet massa * 5.0) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. S30A buffer en kraal massa rekenmachine, voor dag 3 van ruwe Cell Extract protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Concentratie </td><td> Bedrag </td><td> Sterilisatie </td><td> Notes </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Geen </td><td> Tot pH 8 te bereiken, titreren met KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP en GTP, 94 mM CTP en UTP, pH 7,5 </td><td> 1.5 ml </td><td> Geen </td><td> Op pH 7,5 te bereiken, titreren met KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 ul </td><td> Geen </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 ul </td><td> Geen </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 pi </td><td> Geen </td><td> Om pH 7.5-8 bereiken, titreer met Tris op 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 gl </td><td> Geen </td><td> Tot pH 8 te bereiken, titreer met Tris op 2 M. </td></tr><tr><td> Folinezuur </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 pi </td><td> Geen </td><td> Hoewel slechts 300 pi nodig, aanvullende recept is 1.15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidine </td><td> 1 M </td><td> 150 gl </td><td> Geen </td><td> Bewaar bij 4 ° C, warmte tot 37 ° C te smelten. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH 7,5 </td><td> 3.2 ml </td><td> Geen </td><td> Op pH 7,5 te bereiken, titreer met Tris op 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Reagentia te bereiden op Energy Solution protocol. Aanvullend materiaal 1. Recepten voor items. Chlooramfenicol, 34 mg / ml: Bereid 0,51 g chlooramfenicol en voeg 15 ml ethanol. Filter steriliseer (0,22 uM), monster 1 ml buizen, bewaar bij -20 ° C voor later gebruik. 2xYT + P + Cm agar plaat: Bereid 1,24 g 2xYT, 1,6 ml kalium dibasisch oplossing @ 1 M, 0,88 ml kalium monobase oplossing @ 1 M, 0,6 g agar en water tot 40 ml. Autoclaaf. Laat afkoelen tot 50 ° C en voeg 40 ul Cm. Aliquot 25 ml in een 100 x 15 mm petrischaal en laat afkoelen voor een uur. 2xYT + P media: Bereid 124 g 2xYT, 160 ml kalium dibasisch oplossing @ 1 M, 88 ml kalium monobase oplossing @ 1 M, en water tot 4 L. Aliquot uit in 2 x 1,88 L en 0,24 L. autoclaaf. Tris-base, 2 M: Bereid 60.57 g Tris-base en water tot 250 ml. Steriliseren, bewaren bij kamertemperatuur voor later gebruik. DTT, 1 M: Bereid 2,31 g DTT en water tot 15 ml. Filter steriliseer (0,22 uM), monster 1 ml buizen, bewaar bij -20 ° C voor later gebruik. S30A buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 50 ml 2 M Tris van azijnzuur (pH 7,7) en water 2 L. Autoclaaf, bewaren bij 4 ° C, voeg 4 ml 1 M DTT vóór gebruik. S30B buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 2 M Tris (pH 8,2) en water 2 L. Autoclaaf, bewaren bij 4 ° C, voeg 2 ml 1 M DTT vóór gebruik. HEPES: Bereid 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8) en water 4 ml. tRNA: Bereid 30 mg van tRNA en water tot 600 pi. CoA: Bereid 30 mg CoA (MW 767,53) en water tot 600 pi. NAD: Voeg 34.83 mg NAD (MW 663,43), 2 M Tris (pH 7,5-8), en water tot 300 ul. (Voeg 27 ul van 2 M Tris om de oplossing tot pH 7,5-8 brengen). cAMP: Voeg 42.80 mg cAMP (MW 329,22), 2 M Tris (pH 8), en water tot 200 ul. (Voeg 73 ul van 2 M Tris om de oplossing tot pH 8 te brengen). Folinezuur (33,9 mm): Tot 20 mg vast folinezuur calciumzout (MW 511,5), voeg 1,15 ml water. Spermidine: Bereid 23.55 ul spermidine (MW 145,25) en water tot 150 pi. Bereid bij kamertemperatuur na een korte smelten bij 37 ° C. 3-PGA: Voeg 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), 2 M Tris (pH 7,5), en water tot 3,2 ml. (Voeg 1,73 ml 2 M Tris om de oplossing op pH 7,5 te brengen). Nucleotide Mix: Voeg 145 mg ATP dikaliumzout dihydraat (MW 619,4), 133 mg van GTP dinatriumzout (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumzoutdihydraat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumzout dihydraat (MW 586,12) , KOH 15% verdunning (tot pH 7,5) en 1,5 ml water. (Voeg 353 ul van KOH 15% verdunning om de oplossing op pH 7,5 te brengen). Aanvullend materiaal 2. Bradford assay. <ol><li> Verwijder Bradford middel uit 4 ° C en ingesteld op kamertemperatuur. </li><li> Bereid 50 gl BSA standaard 1 mg / ml en bij 0,1 mg / ml. </li><li> Bereid 40 pi 20x verdunning van het extract van stap 1.47. </li><li> Voeg 800 ul water tot 7 cuvetten. </li><li> Bereid standaard cuvetten van 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ul 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 pl 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ui 1 mg / ml BSA). </li><li> Bereid experimentele cuvetten van 2 pl monster en 4 ui monster. </li><li> Voeg 200 ul van Bradford agent steeds cuvet en meng goed by pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten. </li><li> Produceren standaard curve bij OD 595 nm met behulp van cuvetten uit stap 6.5. Standaardcurve afwijzen indien r 2 &lt;0.95. </li><li> Bepaal extract concentratie bij OD 595 nm met behulp van cuvetten uit stap 6.6. </li></ol> Aanvullend materiaal 3. Buffer kalibratie spreadsheet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Zie TXTL_e (template) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Aanvullend materiaal 4. Celvrije meningsuiting lopen spreadsheet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Zie TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Een test voor het meten van de activiteit van de Escherichia coli Induceerbare Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detectie van Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 cellen door PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem