Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
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Wir danken Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere und Enoch Yeung für die Unterstützung Straffung des Protokolls und Clare Chen und Lee Barclay für die Unterstützung in den frühen Phasen des Projekts. Dieses Material wird auf der Arbeit zum Teil von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) unterstützt Gießereien Wohnprogramm, Vertragsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS wird auch durch ein UCLA / Caltech Medical Scientist unterstützt auf Basis Training Program Kameradschaft und durch eine DoD, Air Force Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. Die in diesem Dokument enthaltenen Ansichten und Rückschlüsse sind die der Autoren und sollte nicht als Darstellung interpretiert werden offiziell Politik, weder ausdrücklich noch stillschweigend, von der Defense Advanced Research Projects Agency oder der US-Regierung.

<ol>
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Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die endogene Escherichia coli basierten hier beschriebenen TX-TL zellfreien Expressionssystem ist ein einfach-to-run drei U-Reaktion, die weniger als acht Stunden von bis zu Sammeln von Daten erfolgen kann. Der Prozess der Erstellung alle Reagenzien erfordert fünf Tage Zeit insgesamt (mit erheblichen Arbeitsaufwand nur an einem Tag), produziert aber Rohextrakt für 3000 Reaktionen und Pufferherstellung Reagenzien für 10.000 Reaktionen (Abbildung 1). Außerdem Rohextrakt und Pufferherstellung Reagenzien sind bei -80 ° C für mindestens 1 Jahr stabil, so dass für Mehrfachnutzung einer Zubereitung 4 Bei $ 0,11 pro 10 ul-Reaktion ($ 0,26 einschließlich Arbeits). Sind die Kosten 98% niedriger als bei vergleichbaren Kommerzielle Systeme (Abbildung 2). Es gibt einige ungelöste Einschränkungen, jedoch zu dem System. Das Ende Effizienz jedes Zellrohextrakt Vorbereitung kann auf der Basis der Anwenderkenntnisse und den Umgebungsbedingungen variieren, obwohl typische Ertragsabweichung zwischen 5-10% (Abbildung 4b). Als Ergebnis sind Batch-zu-Batch-Variabilität im Endpunkt-Expression und der Expression Dynamik zu erwarten. Diese Schwankungen werden wahrscheinlich bleiben, bis Extrakt wird vollständig charakterisiert oder bis Extrakt Schöpfung ist voll automatisiert. Wenn der zellfreien Expressionssystem wird verwendet, um empfindliche quantitative Experimente durchzuführen, ist es ratsam, alle Experimente mit der gleichen Charge von Zellrohextrakt laufen. Die Ausbeute aus einer Zellrohextrakt Charge, etwa 3000 Reaktionen, sollte für typische experimentelle Kurse sein. Obwohl wir vermuten Variation kann durch die Skalierung und die Automatisierung der Verfahren entfernt werden, würden solche Versuche eine wesentliche Ressource Investitionen. Zusätzlich, obwohl Endpunkt Expressionsspiegel sind relativ einfach zu bestimmen, muss mehr Arbeit zu verstehen Dynamik intrinsische zum zellfreien System durchgeführt werden. Es ist bekannt, dass sowohl Ressourcen-WETTBEWERBn-und Ressourcenbegrenzung kann Ausdruck Dynamik beeinflussen. Zum Beispiel können begrenzte endogenen Sigma-70 in einem Sättigungsregime mit erhöhter DNA-Matrize Herstellung eines Expressionsprofil analog zu der Nukleotid-oder Aminosäureabbau führen. 9,27 jedoch Dynamik müssen nicht vollständig verstanden, das System zu nutzen. Für reine Ertragssteigerungen kann die Optimierung von Maschine-Learning-Ansätze durchgeführt werden. 28. Fragen der Ressourcen Wettbewerb und Einschränkung kann durch mathematische Modelle angesprochen werden mit experimentellen Daten verifiziert. Die hier vorgestellten Protokoll für ein BL21-Stamm Rosetta2 optimiert, aber ist verallgemeinerbar zu anderen E. coli-Stämme. Änderungen in BL21-Rosetta2, wie die Entfernung des Gens lon-Protease und die Zugabe von Genen seltenen tRNAs kodieren, ermöglichen maximale Proteinproduktion. BL21 und BL21 nur trxA Knockout-an - Wir haben das Protokoll mit zwei anderen Stämmen versucht Extraktd gefunden 50% weniger Proteinausbeute. Wir vermuten, dass die Renditen ähnlich, wenn andere Stämme zu verringern. Weitere Änderungen in den Parametern, wie z. B. Schalt 2xYT Wachstumsmedium für LB und andere reiche Brühen, haben zu einer verminderten Proteinausbeute führte. Zellfreie Expression Systeme, die sowohl endogene als auch exogene Transkriptions-Translations-Maschinen und Regulationsmechanismen haben breite Anwendungen in der Protein-und Metabolit-Expression und in der synthetischen Biologie. 3,29 Anstatt auf T7-regulierten Stromkreise beschränkt, kann man sich vorstellen Herstellung von komplexen Biomolekülen in einer vom Benutzer steuerbare Einstellung mit einer Mischung aus nativen E. coli-Promotoren und exogen zugeführtem Transkriptions-und Regulationsmechanismen. Ohne Einschränkungen der Zellteilung und den Stoffwechsel, können Schwankungen in der synthetischen Schaltungen wie der repressilator oder in Stoffwechselwege entwickelt, wie solche Herstellung von Artemisinin reduziert oder besser verstanden. 30,31 Wir have verwendet, diese Vorteile zu genetischen Schalter zu implementieren, sowie Sigma-Faktor-Sequestrierung versteht 9,32 Diese Technologie kann auch das Rückgrat der &quot;minimal&quot; oder &quot;künstliche&quot; Zellen bilden -. kleinen, gut gekennzeichnet und autark verkörperten Einheiten Extrakt. 33,34 Letztendlich erwarten wir sofort Nutzungen dieser endogenen zellfreie Expressionssystem als Prototyping-Umgebung für synthetische Biologie. Den Spitznamen &quot;TX-TL biomolekularen Steckbrett&quot;, das zellfreie Expressionssystem bietet eine Umgebung, in der steuerbaren Kunstkreise letztlich für die in vivo-Expression kann bestimmt Runden Prototyping unterziehen - Testzyklen auf Basisplasmid, linear, oder chemisch synthetisierte DNA, gefolgt durch Analyse und schnelle Änderung. Prototyping Runden kann durch mathematische Vorhersagemodelle entwickelt derzeit unterstützt werden. Durch das Entfernen von Klonen und in vivo-Manipulation für nicht-finale Kreise erwarten wir Ingenieuretechnik Zykluszeiten auf 1-3 Tage statt der aktuellen Wochen-Standard reduziert werden.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Zellfreie Expression Technologie begann in den 1950er Jahren als rein translatorische, voran Jahre später gekoppelten Transkriptions-Translationsmechanismen umfassen unter Verwendung von T7 Bakteriophagen-DNA. 11,12 Seitdem wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen worden, um die Erstellung von rohen Zellextrakt (oder E optimieren . coli S30-Extrakt). 13,14 Diese Optimierungen umfassen Verlängerung zellfreien Proteinsynthese durch ATP-Regeneration oder Belastung Modifikationen und Protokoll reduziert Zeit und Kosten. 15-17 Alternative zellfreie Expressionssysteme existieren, die Verwendung wiederhergestellten Komponenten anstelle von Rohöl Zellextrakt zur Expression. 5 Sowohl Zellrohextrakt und Rekonstitution Methoden für den kommerziellen Einsatz entwickelt worden. Mit dem Aufkommen der synthetischen Biologie, gibt es einen erhöhten Bedarf für eine gut charakterisierte Plattform zu testen und Express entwickelt biologische Module und Schaltungen. 18,19 Diese Plattform mussvielseitig, gut charakterisiert, einfach zu manipulieren und auf Benutzer gelieferten Komponenten konzentriert. Obwohl er ein halbes Jahrhundert früher entwickelt, die zellfreie Systeme auf E. coli eigen teilen diese Anforderungen, da sie eine vereinfachte Darstellung der in-vitro-zelluläre Prozesse, ohne die Komplexität des Wachstums und des Stoffwechsels sind. Zusätzlich werden alle der grundlegenden Kenntnisse aus in vivo-Arbeit an E. coli gilt ohne weiteres auf E. coli zellfreien Systemen. Obwohl zellfreien Expressionssystemen können Anwendungen in der synthetischen Biologie haben, um das Ziel der meisten zellfreie Expressionssysteme datieren ist die Maximierung der Protein-und Metabolit-Ausbeute. Dies wird durch Verwendung von T7-Bakteriophagen Transkription von Sequenzen durch T7-Promotoren gesteuert durchgeführt. 20. Obwohl die Expression ist effizient und robust, diese Systeme dienen einem hoch spezialisierten Zweck. Zellregulation Methoden sind begrenzt, muss Ziel-DNA-Vorlagen seinüberarbeitet, um T7-Promotoren sind, und bestimmte Sequenzen, wie ribosomale Komplexe können nicht transkribiert und zusammengebaut werden. 21,22 Bestehende zellfreie Expressionssysteme sind nicht in der Lage, hohe Ausbeuten zu erhalten, während die Erhaltung endogenen Regulationsmechanismen, eine Vielseitigkeit für synthetische Biologie erforderlich. Wir haben eine endogene E. entwickelt coli zellfreien Expressionssystem, das die Effizienz der Proteinexpression von früheren Systemen nachgewiesen bewahrt aber fügt zusätzliche Vielseitigkeit, indem es die Expression und Regulation der Grundlage von sowohl endogenen als auch exogenen (T7 oder andere) Mechanismen. Das hier beschriebene Protokoll wird ursprünglich auf Kigawa et al. (2004) und Liu et al. (2005), hat aber wesentliche Änderungen. Es nutzt Mg-und K-Glutamat über Mg-und K-Acetat für mehr Effizienz, entfernt 2-Mercaptoethanol und lysiert Zellen mit einer Wulst-Beater. 17,23,24 Bead-Schläge über Homogenisierung gewählt,druckbasierten Verfahren oder Ultraschallbehandlung aufgrund ihrer geringeren Kosten und vergleichbaren Ausbeuten zu Konkurrenzsystemen. wird 23 3-Phosphoglycerinsäure (3-PGA) als Energiequelle verwendet, da festgestellt wurde, verglichen mit Kreatinphosphat überlegenen Ausbeuten und Protein Phosphoenolpyruvat. 4,25 Unser System kann bis zu 0,75 mg / ml Reporterprotein zu produzieren entweder mit einem sigma70 basierte Promotor mit Lambda-Phagen-Betreiber oder einen T7-Promotor angetrieben, ähnlich wie die Erträge aus anderen kommerziellen Systemen. 4,6 Fünf Tage sind erforderlich, um alle notwendigen Reagenzien (Abbildung 1) zu produzieren. Darüber hinaus bietet es eine 98% Kostenersparnis gegenüber vergleichbaren kommerziellen zellfreien Systemen - Materialkosten sind $ 0,11 pro 10 ul-Reaktion, die auf $ 0,26 mit der Arbeit enthalten (Abbildung 2) steigt.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Ideal zellfreie Expressionssysteme können theoretisch emulieren einen zellulären in vivo-Umgebung in einem in vitro-Plattform gesteuert. 1 Dies ist nützlich für die Expression von Proteinen und genetischen Schaltungen kontrolliert, sowie zum Bereitstellen einer Prototypumgebung für synthetische Biologie. 2,3 Um letzteres Ziel zu erreichen, zellfreie Expressionssysteme, die erhalten endogenen Escherichia coli Transkriptions-Translations-Mechanismen sind in der Lage, in vivo zellulären Dynamik als solche auf Basis von T7-RNA-Polymerase-Transkription genauer widerspiegeln. Wir beschreiben die Vorbereitung und Durchführung eines effizienten endogenen E. coli basiert Transkriptions-Translations-(TX-TL) zellfreien Expressionssystem, das äquivalente Mengen an Protein, wie T7-basierten Systemen zu einer Kostenreduktion bis zu 98% ähnlich wie kommerzielle Systeme produzieren kann. 4,5 Die Herstellung von Puffern und rohem Zellextrakt beschrieben, sowie die Ausführung einesdrei U-TX-TL-Reaktion. Das gesamte Protokoll dauert fünf Tage, um vorzubereiten und liefert genug Material für bis zu 3000 einzelne Reaktionen in einer Zubereitung. Einmal hergestellt, nimmt jeder Reaktion unter 8 Stunden von der Einrichtung der Datensammlung und-analyse. Mechanismen der Regulation und Transkription exogener E. coli, wie lac / Tet-Repressoren und T7-RNA-Polymerase, ergänzt werden. 6 Endogene Eigenschaften, wie mRNA und DNA-Abbauraten können ebenfalls eingestellt werden. 7 Der TX-TL zellfreien Expressionssystem für nachgewiesen groß Maßstab Schaltungsanordnung, die Erkundung der biologischen Phänomene und Expression von Proteinen unter beiden T7-und endogene Promotoren. 6,8 Begleitende mathematische Modelle zur Verfügung stehen. 9,10 Das resultierende System hat einzigartige Anwendungen in der Synthetischen Biologie als Prototyping-Umgebung, oder &quot;TX- TL biomolekularen Steckbrett. &quot;

Wir haben einen Fünftage Protokoll zur Herstellung eines endogenen Escherichia coli basieren TX-TL zellfreien Expressionssystem dargestellt. Eine Probe Timeline für die Erstellung der Reagenzien - Zellrohextrakt und Puffer - ist in Abbildung 1 zu finden. Einmal erzeugt, so können diese bei -80 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. Nach Reagenzien erstellt sind, können Versuchsaufbau und Durchführung in weniger als 8 Stunden durchgeführt werden. Darüber hinaus optimiert die Expression Bedingungen des TX-TL zellfreien Expressionssystem. Andere Benutzer angegebenen Zusätze wie Puffer oder DNA-Lösungen sollten für Toxizität vorher kalibriert werden. Zum Beispiel ergeben sich unterschiedliche Verfahren der Verarbeitung Plasmide in anderen Ausdruck durch Salzgehalt. Wir testeten auch die Wirkung von Tris-Cl Elutionspuffer auf die Reaktionseffizienz (Abbildung 5). Ein Beispiel eines rohen Zellextrakt Kalibrierung Bezugnahme Schritt 4,1 bis 4,9, dargestelltin Fig. 4a. Im allgemeinen zeigen unsere Versuche, dass der rohe Zellextrakt ist am empfindlichsten für Mg-Glutamat auf, gefolgt von K-Glutamat-Niveaus. Um die zellfreie Expressionssystem zu demonstrieren, konstruierten wir getestet und eine negative Rückkopplungsschleife auf der Basis tet Repression. 26 (Abbildung 6). In zellfreien Expressionssystem, die gleiche Schaltung Lauf mit und ohne ATC zeigt eine 7-fach-Endpunkt Ausdruck Wechsel deGFP Reporter nach acht Stunden des Ausdrucks. Obwohl dieses Experiment nicht erfordern globale Induktoren oder Repressoren, wenn nötig können sie unter &quot;Master Mix Vorbereitung.&quot; Hinzugefügt werden <img alt="Figur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Timeline für rohen Zellextrakt, Aminosäure-Lösung und Energielösung Vorbereitung. Ein Fünf-Tages-timelin<html> e für eine typische Ausführung des Protokolls ist oberhalb, da über Nacht Inkubationen und Tagesarbeitsschritte optimiert. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> 2. Kosten-und Expressionsanalyse von konkurrierenden rohen Zellextrakten. a) Aufschlüsselung der Kosten der Arbeit und Materialien der TX-TL zellfreien Expressionssystem. Basierend auf Kosten der Reagenzien im Dezember 2012 und der Arbeitskosten von $ 14 pro Stunde. B) Vergleich der TX-TL zellfreie Expressionssystemkosten im Vergleich zu anderen kommerziellen Systemen. Kosten werden pro ul gebrochen, obwohl Reaktionsvolumina pro Set. C) Vergleich der TX-TL zellfreien Expressionssystem Ausbeute im Vergleich zu anderen kommerziellen Systemen variieren. Proteinexpressionsausbeute von Herstellernormen festgelegt./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> 3. Be-und Verarbeitung von einer Wulst-schlagRohr. a) Demonstration der richtigen Viskosität von Zell-Bead-Lösung. Zell-Bead-Lösung wird eine Viskosität von vielen Faktoren abhängig, einschließlich Höhe der S30A-Puffer, Menge von Perlen aufgenommen, und die Zeit auf dem Eis verbracht. B) Laden der Wulst-Rohr schlagen vor schnellen Tisch Zentrifugieren. Die Zentrifugation entfernt Blasen während des Ladens angesammelt. C) Blasen nach Tisch Zentrifugation Beschichten. Die Größe der Blasen wird variieren, sie können aufgetaucht oder entfernt werden, mit einer Pipettenspitze d) vollständig gefülltes Kügelchen-Spiel gegen Rohr vor der Deckelung.. Ein Meniskus im Wulst-schlagen t gebildetube, und die Kappe hat genug zu decken und zu kleinen Mengen. füllen E) korrekt geladen Filtergerät. Diese können. F) Vergleich der richtig gegen falsch verarbeitet Perlen schlagen Rohr wiederverwendet werden. Das Rohr auf der linken Seite ist ein gut-Beat Rohr - es verfügt über eine kleine, gut abgegrenzte Oberschicht, und sehr klare Überstand. Das Rohr auf der rechten Seite nicht optimal sein, basierend auf dem größeren, trübe zweiten Schicht und der trübe Überstand. Rohre, die nicht optimal sind, sollten nicht weitere Verarbeitung erfolgt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> 4. Eigenschaften der Rohextrakt Zubereitungen. a) Typische Eichkurven für Zellrohextrakt. Rohextrakt wird für weitere Mg-Glutamat, K-Glutamat und DTT Niveaus kalibriert ist, in dieser Reihenfolge. Dargestellt ist Endpunkt fluorescence nach 8 h, sowie maximale Rate der Proteinproduktion auf der Basis einer 12-minütigen Bewegungsdurchschnitt. Basierend auf diesen Grundstücken, ein akzeptables Angebot an Zusatz Mg-Glutamat ist 4 mM, K-Glutamat ist 60-80 mM, DTT und 0-3 mM. Beachten Sie, dass jedes Rohextrakt muss unabhängig für diese drei Variablen kalibriert werden. B) Änderung von Extraktpräparaten. Endpoint Fluoreszenz von zwei Rohextrakte an verschiedenen Tagen vorbereitet wird gezeigt, Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> 5. Auswirkungen der DNA-Lösung auf die Expression Effizienz. a) Vergleich von zwei unterschiedlichen ReinigungsVerfahren zur Verarbeitung von Plasmiden. 1 nM pBEST-OR 2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 ist mit nur einem QIAprep Spin Miniprep Kit (Reinigung Methode 1) oder mit einem QIAquick PCR Purification Kit nachbearbeitet vorbereitet (Reinigung Methode 2). Dargestellt ist Endpunkt Fluoreszenz nach 8 Stunden, sowie maximale Rate der Proteinproduktion auf der Basis einer 12-minütigen gleitenden Durchschnitt. Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus vier unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. B) Wirkung der Elutionspuffer (Tris-Cl). Verschiedene Konzentrationen von Tris-Cl in einer zellfreien Expressions Reaktion basierend auf der Expression von 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 verglichen. Angegebenen Konzentrationen sind Endkonzentrationen von Tris-Cl in der Reaktion; Elutionspuffer ist 10 mM Tris-Cl. Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <p class="jove_content" fo:Keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> 6. Beispiel TX-TL Lauf einer negativen Rückkopplungsschleife. a) Proben Einrichtung eines zellfreien Ausführung Reaktion. Tests &quot;auf&quot; gegen &quot;Aus&quot;-Zustand der negativen Rückkopplungsschleife, mit positiven und negativen Kontrollen. B) Plasmid Karte von negativen Rückkopplungsschleife. C) Repräsentative Ergebnisse. Daten spiegelt Experiment in a) und b) mit Negativkontrolle aus Signal subtrahiert. Genetische Schaltung in Einsatz gezeigt. Fehlerbalken sind 1 Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen an verschiedenen Tagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td><td> Sterilisation </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> Chloramphenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml in Ethanol </td><td> 1 ml </td><td> Filter zu sterilisieren (0,22 uM) </td><td> In größeren Mengen bei -20 º C zur späteren Verwendung gelagert werden. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm-Agar-Platte </td><td> 31 g / l 2 × YT, 40 mM Kaliumhydrogenphosphat, 22 mM monobasisches Kaliumphosphat, 34 ug / ml Chloramphenicol </td><td> 1 Platte </td><td> Autoklav </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P Media </td><td> 31 g / l 2 × YT, 40 mM Kaliumhydrogenphosphat, 22 mM Kaliumphosphat, monobasisches </td><td> 4 L </td><td> Autoklav </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien für Tag 1 der Zellrohextrakt Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Konzentration </strong&gt; </td><td> Menge </td><td> Sterilisation </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filter zu sterilisieren (0,22 uM) oder Autoklaven </td><td> Kann bei Raumtemperatur gelagert werden. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filter zu sterilisieren (0,22 uM) </td><td> In größeren Mengen hergestellt und bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden. </td></tr><tr><td> S30A-Puffer </td><td> 14 mM Mg-Glutamat, 60 mM K-Glutamat, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> Um pH 7,7 zu ​​erreichen, titriert mit Essigsäure. In DTT bis 2 mM Endkonzentration kurz vor der Verwendung. Lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td> S30B Puffer </td><td> 14 mM Mg-Glutamat, 60 mM K-Glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> Auf pH 8,2 zu erreichen, titriert mit 2MTris. Hinzufügen DTT 1 mM Endkonzentration kurz vor der Verwendung. Lagern bei 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien für Tag 2 von Zellrohextrakt Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falke </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Leere 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon mit Pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pelletmasse (50 ml Falcon mit Pellets - leer 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A Puffervolumen zu addieren (Pelletmasse * 0,9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gesamtmasse von Perlen hinzufügen (Pelletmasse * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. S30A Puffer-und Perlenmassen Rechner, für Tag 3 der Zellrohextrakt Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Konzentration </td><td> Menge </td><td> Sterilisation </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8, </td><td> 4 ml </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 8 zu erreichen, titriert mit KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP und GTP, 94 mM CTP und UTP, pH-Wert 7,5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 7,5 zu erreichen, titriert mit KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 ul </td><td> Keiner </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 ul </td><td> Keiner </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 ul </td><td> Keiner </td><td> Um pH-Wert von 7,5 bis 8 erreichen, titriert mit Tris bei 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8, </td><td> 200 ul </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 8 zu erreichen, titriert mit Tris bei 2 M. </td></tr><tr><td> Folinsäure </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 ul </td><td> Keiner </td><td> Obwohl nur 300 ul benötigt wird, ist Rezept für zusätzliche 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> 1 M </td><td> 150 ul </td><td> Keiner </td><td> Lagerung bei 4 ° C Hitze auf 37 ° C zu schmelzen. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Keiner </td><td> Auf pH 7,5 zu erreichen, titriert mit Tris bei 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Reagenzien für Energy Solution-Protokoll vorzubereiten. STADT Werkstoff 1. Rezepte für Gegenstände. Chloramphenicol, 34 mg / ml: Bereiten 0,51 g Chloramphenicol und fügen Ethanol auf 15 ml. Filter zu sterilisieren (0,22 uM), aliquote 1-ml-Röhrchen bei -20 ° C für die spätere Verwendung. 2xYT + P + Cm-Agar-Platte: Bereiten 1,24 g 2xYT, 1,6 ml Kaliumhydrogenphosphat-Lösung @ 1 M, 0,88 ml Kaliumphosphat einbasischen Lösung @ 1 M, 0,6 g Agar und Wasser auf 40 ml. Autoklav. Abkühlen lassen bis 50 ° C und 40 &amp;mgr; l Cm. Aliquot 25 ml in einen 100 x 15 mm Petrischale, und abkühlen lassen für eine Stunde. 2xYT + P Media: Vorbereiten 124 g 2xYT, 160 ml Kaliumhydrogenphosphat-Lösung @ 1 M, 88 ml Kaliumphosphat einbasischen Lösung @ 1 M, und Wasser auf 4 L. Aliquot heraus in 2 x 1,88 L und 0,24 L Autoklav. Tris-Base, 2 M: Bereiten 60,57 g Tris-Base und Wasser auf 250 ml. Sterilisieren, Lagerung bei RT für die spätere Verwendung. DVB-T, 1 M: Bereiten 2,31 g DTT und Wasser auf 15 ml. Filter zu sterilisieren (0,22 uM), aliquote 1-ml-Röhrchen bei -20 ° C für die spätere Verwendung. S30A Puffer: Bereiten 10,88 g Mg-Glutamat und 24.39 g K-Glutamat, 50 ml Tris bei 2M, Essigsäure (pH-Wert 7,7) und Wasser auf 2 L Autoklav, Lagerung bei 4 ° C, 4 ml 1 M DTT vor der Verwendung. S30B Puffer: Bereiten 10,88 g Mg-Glutamat und 24.39 g K-Glutamat, Tris bei 2 M (pH 8,2) und Wasser auf 2 L Autoklav, Lagerung bei 4 ° C, 2 ml 1 M DTT vor dem Gebrauch. HEPES: Vorbereiten 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8), und 4 ml Wasser zu. tRNA: Vorbereitung 30 mg tRNA und Wasser zu 600 ul. CoA: Bereiten 30 mg CoA (MW 767,53) und Wasser zu 600 ul. NAD: Fügen 34.83 mg NAD (MW 663,43), Tris bei 2 M (pH 7,5-8) und Wasser auf 300 ul. (Add 27 ul Tris bei 2 M, um die Lösung auf pH 7.5-8 mitbringen). cAMP hinzu: 42.80 mg cAMP (MW 329,22), Tris bei 2 M (pH 8) und Wasser auf 200 ul. (In 73 ul 2 M Tris bei, um die Lösung auf pH 8 zu bringen). Folinsäure (33,9 mm): Zu 20 mg Fest Folinsäure Calciumsalz (MW 511,5), fügen 1,15 ml Wasser. Spermidin: Bereiten 23,55 ul Spermidin (MW 145,25) und Wasser zu 150 ul. Vorbereitung bei Raumtemperatur nach kurzem Schmelzen bei 37 ° C 3-PGA: In 1,03 g 3-PGA (MW 230.02), bei 2 M Tris (pH 7,5) und 3,2 ml Wasser zu. (In 1,73 ml an 2 M Tris, die Lösung auf pH 7,5 zu bringen). Nucleotide Mix: In 145 mg ATP Dikaliumsalzes Dihydrat (MW 619,4), 133 mg GTP Dinatriumsalz (MW 567,14), 79,4 mg CTP Dinatriumsalzdihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP Trinatriumsalzes Dihydrat (MW 586,12) KOH in 15% iger Verdünnung (pH 7,5) und 1,5 ml Wasser zu. (In 353 &amp;mgr; l KOH bei 15% Verdünnung, um den pH auf 7,5 zu bringen). STADT Material 2. Bradford-Assay. <ol><li> Bradford entfernen Mittel von 4 ° C und bei Raumtemperatur einstellen. </li><li> Vorbereitung 50 ul BSA-Standard in 1 mg / ml und 0,1 mg / ml. </li><li> Bereiten Sie 40 ul 20x Verdünnung von Extrakt aus Schritt 1.47. </li><li> In 800 ul Wasser bis 7 Küvetten. </li><li> Vorbereitung Standardküvetten für 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 &amp;mgr; l 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 &amp;mgr; l 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 &amp;mgr; l 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ul 1 mg / ml BSA). </li><li> Vorbereitung experimentellen Küvetten 2 ul Probe und 4 ul Probe. </li><li> In 200 ul von Bradford Mittel zu jeder Küvette und gut mischen by Pipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. </li><li> Produzieren Standardkurve bei OD 595 nm mit Küvetten aus Schritt 6.5. Ablehnen Standardkurve, wenn r 2 &lt;0,95. </li><li> Bestimmen Extrakt-Konzentration bei OD 595 nm mit Küvetten aus Schritt 6.6. </li></ol> STADT Werkstoff 3. Puffer Kalibrierung Tabelle. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Siehe TXTL_e (Vorlage) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Zusatzmaterial 4. Zellfreie Ausdruck laufen Tabellenkalkulation. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Siehe TXTL _JoVE.xlsx</a> .

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Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

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