Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

אנו מודים Jongmin קים, דן סיגל-Gaskins, Anu Thubagere, וחנוך Yeung לסיוע התייעלות הפרוטוקול, וקלייר חן וברקלי לי לסיוע בשלבים המוקדמים של הפרויקט בשלבים. חומר זה מבוסס על נתמך בחלקו על ידי ההגנה מחקר מתקדם פרויקטים הסוכנות (DARPA / MTO) תכנית החיים יציקה, מספר חוזה HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS נתמך גם על ידי מדען רפואי UCLA / קלטק העבודה מלגת תכנית אימונים ועל ידי משרד ההגנה, חיל אוויר Office של מחקר מדעי, ביטחון הלאומי, מדע והנדסה לתואר שני (NDSEG) מלגה, 32 168a CFR. הדעות והמסקנות הכלולות במסמך זה הן על דעת המחברים ולא צריך להתפרש כמייצג באופן רשמי מדיניות, במפורש או במשתמע, של הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם הביטחון או ממשלת ארה&quot;ב.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מבוסס חיידקי Escherichia אנדוגני שתוארה כאן היא תגובה שלושה צינור קלה לטווח שיכול לקחת פחות משמונה שעות מלהגדיר לאיסוף נתונים. התהליך של יצירת כל ריאגנטים דורש חמישה בסך הכל &#39;ימי זמן (עם דרישות עבודה משמעותיות על יום אחד בלבד), אבל מייצר תמצית גולמי ל3,000 תגובות וריאגנטים ל10,000 תגובות (איור 1), מה שהופך את החיץ. יתר על כן, תמצית גולמי וחומרים כימיים יציבים במשך שנה לפחות 1 ב -80 מעלות צלזיוס, דבר המאפשרים לשימושים מרובים של הכנה אחד קבלת חיץ. 4 ב0.11 דולרים ל10 תגובת μl (0.26 $ כוללים עבודה), עלויות הן 98% בהשוואה להשוואה מערכות מסחריות (איור 2). ישנן מספר מגבלות בלתי פתורות, עם זאת, למערכת. יעילות סוף כל הכנת תמצית תא גולמי יכולה להשתנות על סמך בקיאות משתמש ועל תנאים סביבתיים, אם כי לאוריאציה תשואת ypical היא בין 5-10% (איור 4). כתוצאה מכך, השתנות אצווה כדי אצווה בשני ביטוי נקודת הסיום ובדינמיקת ביטוי הן צפויות. וריאציות אלו צפויות להישאר עד התמצית מאופיינת או עד יצירת תמצית היא אוטומטית לחלוטין באופן מלא. אם מערכת הביטוי ללא תא משמשת לבצע ניסויים כמותיים רגישים, רצוי להפעיל את כל הניסויים עם אותה הקבוצה של תמצית תא גולמי. התשואה מתצווה אחת תמצית תא גולמי, על 3000 תגובות, צריכה להיות מספיק עבור קורסים ניסיוניים טיפוסיים. למרות שאנו חושדים וריאציה ניתן להסיר על ידי דרוג את ומיכון ההליך, ניסיונות כאלה היינו כרוכים בהשקעת משאבים משמעותית. בנוסף, למרות שרמות ביטוי נקודת סיום הן קלים באופן סביר על מנת לקבוע, עוד עבודה שצריכה לעשות בדינמיקת הבנה פנימית למערכת ללא תא. זה ידוע כי שניהם competitio המשאבהגבלת n ומשאבים יכולה להשפיע על דינמיקת ביטוי. לדוגמא, סיגמא אנדוגני המוגבל 70 יכול לגרום למשטר להרוות עם תבנית ה-DNA מוגבר לייצר פרופיל ביטוי מקביל לזה של דלדול נוקלאוטיד או חומצת אמינו. 9,27 עם זאת, דינמיקה לא צריך להיות מובנת במלוא לנצל את המערכת. לעלייה טהורה של תשואה, אופטימיזציה יכולה להיעשות על ידי גישות למידה מכונה. 28 שאלות של תחרות משאבים והגבלה ניתן לטפל על ידי מודלים מתמטיים לאמת באמצעות נתונים ניסיוניים. הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לזן BL21-Rosetta2, אבל הוא להכליל את א &#39;אחרת זני חיידק. שינויים בBL21-Rosetta2, כגון הסרת פרוטאז גן הקידוד לון והתוספת של הגנים המקודדים tRNAs הנדיר, לאפשר לייצור חלבון מקסימאלי. יש לנו ניסיון בפרוטוקול עם שני זני תמצית אחרים - BL21 בלבד ונוקאאוט-BL21 trxAד מצא תשואת חלבון 50% פחות. אנו משערים כי תשואות דומות להקטין בעת ​​שימוש בזנים אחרים. שינויים אחרים בפרמטרים, כגון החלפת מדיום גידול 2xYT עבור LB ומרקים עשירים אחרים, הביאו לתשואת חלבון ירד. יש מערכות ביטוי תא ללא ניצול שני מכונות שעתוק-תרגום אנדוגני ואקסוגני ומנגנוני רגולציה יישומים רחבים בחלבון וגם ביטוי המטבוליט ובביולוגיה סינתטית. 3,29 במקום להיות מוגבל למעגלים מוסדרים T7, אפשר לדמיין הפקת ביומולקולות המורכבת בהגדרת משתמש לשליטה באמצעות שילוב של א &#39;ילידים יזמים coli ומנגנוני שעתוק ורגולציה מסופקים אקסוגני. ללא מגבלות של חלוקת תא וחילוף חומרים, השתנות במעגלים סינטטיים כגון repressilator או במסלולים מטבוליים מהונדס כגון ארטמיסינין הייצור אלה יכולים להיות מופחתים או להבין טובים יותר. 30,31 אנו havדואר משמש יתרונות אלה ליישם מתגים גנטיים, כמו גם להבין את תפיסת גורם סיגמא טכנולוגיה זו 9,32 יכולה גם מהווה את עמוד השדרה של תאים &quot;מלאכותיים&quot; &quot;מינימאלי&quot; או -. קטן, מאופיין היטב ויחידות גלומות עצמאית של תמצית. 33,34 סופו של דבר, אנו צופים שימושים מיידיים של מערכת ביטוי זה אנדוגני תא ללא כסביבת דיגום לביולוגיה סינתטית. כינוי &quot;קרש חיתוך biomolecular TX-TL,&quot; מערכת ביטוי התא ללא מספקת סביבה לשליטה בו מעגלים סינטטיים נועדו סופו של דבר לin vivo ביטוי יכול לעבור סיבובים של בניית אב טיפוס - מחזורים של בדיקות על פלסמיד הבסיסי, ליניארי, או דנ&quot;א synthetized כימי, ואחריו על ידי ניתוח ושינוי מהיר. יכולים להיות בעזרת סיבובים prototyping על ידי מודלים מתמטיים חזוי כרגע בשלבי פיתוח. על ידי הסרת שיבוט ובמניפולצית vivo למעגלים שאינם סופיים, אנו צופים engiזמני מחזור חלוצית ליופחתו ל 1-3 ימים במקום סטנדרטית &#39;השבועות הנוכחיים.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

טכנולוגית ביטוי תא ללא החלה ב1950s כגרידא translational, קידום שנים מאוחר יותר על מנת להקיף מנגנוני שעתוק-תרגום בשילוב באמצעות DNA bacteriophage T7. 11,12 מאז, מאמצים רבים נעשו כדי לייעל את הקמתה של תמצית תא גולמי (או E . תמצית coli S30). 13,14 אופטימיזציות אלו כוללות הארכת סינתזת חלבון ללא תא דרך התחדשות ATP או שינויי מתח, וצמצום זמן פרוטוקול ועלות. 15-17 מערכות ביטוי תא ללא אלטרנטיביים קיימות שרכיבי שימוש מחדש במקום גולמי תא תמצית לביטוי. 5 שתי תמצית תא גולמי ושיטות הכינון מחדש פותחו לשימוש מסחרי. עם כניסתו של ביולוגיה סינתטית, יש צורך מוגבר פלטפורמה מאופיינת היטב כדי לבחון ולהביע את המודולים ביולוגיים מהונדסים ומעגלים. 18,19 פלטפורמה זו חייבת להיותתכליתי, מאופיין היטב, פשוט לתפעול, ומתמקד ברכיבים המסופק על ידי משתמש. למרות מפותח חצי מאה קודם לכן, מערכות תא ללא מבוססות על E. coli חולק באופן מהותי בדרישות אלה, כפי שהם פשוט יותר בייצוג מבחנה של תהליכים תאיים ללא המורכבות של צמיחה וחילוף חומרים. בנוסף, את כל הידע הבסיסי בעבודה מvivo על E. coli מתייחס בקלות לE. מערכות תא ללא coli. למרות שמערכות ביטוי תא ללא יכולות להיות יישומים בביולוגיה סינתטית, עד היום המטרה של רוב מערכות ביטוי תא ללא כבר מיצוי החלבון ותשואת המטבוליט. המטרה זו מושגת על ידי שימוש בשעתוק bacteriophage T7 של רצפים מונעים על ידי היזמים T7. 20 למרות שהביטוי הוא יעיל וחזק, מערכות אלו לשרת מטרה מאוד מיוחדת. שיטות רגולציה סלולרי הן מוגבלות, תבניות ה-DNA יעד חייבת להיותreengineered לכלול יזמים T7, ולא ניתן עיבד רצפים מסוימים, כגון מתחמי ריבוזומלי ומורכבים. 21,22 מערכות ביטוי תא ללא קיימות לא מצליחות לשמור על תשואות גבוהות תוך שמירה על מנגנוני ויסות אנדוגני, צדדיות הכרחי לביולוגיה סינתטית. פיתחנו ה אנדוגני מערכת תא ללא coli ביטוי שמשמרת את היעילות של ביטוי חלבון הודגמה על ידי מערכות קודמות, אך מוסיפה צדדיות נוסף על ידי המאפשר ביטוי ורגולציה מבוסס על שני במשק ומחוץ מנגנונים (T7 או אחרים). הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס במקור על Kigawa et al. (2004) ויו et al. (2005), אבל יש שינויים משמעותיים. הוא מנצל Mg-ו-K-גלוטמט על Mg-ו-K-אצטט להתייעלות, מסיר 2-mercaptoethanol, וlyses תאים באמצעות חרוז-מקצף. 17,23,24 חרוזים מכות הוא נבחר על פני הומוגניזציה,שיטות המבוסס על לחץ, או sonication בשל עלותו נמוכה יותר ותשואות דומות למערכות מתחרות. 23 חומצת 3-phosphoglyceric (3-PGA) משמשת כמקור האנרגיה כפי שהוא נמצא לתת תשואות חלבון מעולים בהשוואה לקריאטין פוספט ו phosphoenolpyruvate. 4,25 המערכת שלנו יכולה לייצר עד 0.75 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון כתב של שימוש גם אמרגן מבוסס sigma70 עם מפעילי מבדה-הפאג או אמרגן מונע T7, בדומה לתשואות ממערכות מסחריות אחרות. 4,6 חמישה ימים נדרש כדי לייצר את כל חומרים כימיים הנחוצים (איור 1). יתר על כן, הוא מספק הפחתת עלויות 98% בהשוואה למערכות דומות מסחריות תא ללא - עלויות חומר הם 0.11 דולרים ל10 תגובת μl, המתנשא ל -0.26 $ עם עבודה כלולה (איור 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

מערכות ביטוי תא ללא אידיאלית באופן תיאורטי יכולות לחקות סביבה תאית in vivo שבשליטה בפלטפורמת מבחנה. 1 זו שימושית לביטוי חלבונים ומעגלים גנטיים באופן מבוקר, כמו גם למתן סביבת דיגום לביולוגיה סינתטית. 2,3 כדי להשיג את המטרה האחרונה, מערכות ביטוי תא ללא שלשמר מנגנוני שעתוק-תרגום חיידקי Escherichia אנדוגני הם מסוגלים לשקף בצורה מדויקת יותר in vivo דינמיקה הסלולר יותר מאלו המבוססים על שעתוק RNA פולימראז T7. אנו מתארים את ההכנה וביצוע של א אנדוגני יעיל מערכת ביטוי תמלול בתרגום מבוסס coli (TX-TL) ללא תא שיכול לייצר כמויות שווה של חלבון כמו מערכות מבוססות-T7 ב98% הפחתת עלויות למערכות מסחריות דומות. 4,5 הכנת מאגרים ותמצית תא הגולמי הן תואר, כמו גם ביצועתגובת TX-TL שלושה צינור. כל הפרוטוקול לוקח חמישה ימים להכין ומניב מספיק חומר לעד 3000 תגובות בודדות בהכנה אחד. מוכן ברגע, כל תגובה לוקחת פחות מ -8 שעות מהתקנה לאיסוף וניתוח הנתונים. מנגנונים של רגולציה ואקסוגניים שעתוק לE. coli, כגון repressors אק / ט ופולימראז T7-RNA, ניתן להשלים. 6 נכסים אנדוגני, כגון ה-mRNA ושיעורי השפלה DNA, יכול גם להיות מותאם. 7 מערכת ביטוי התא ללא TX-TL הוכח עבור גדול הרכבה בקנה מידה במעגל, לחקור תופעות ביולוגיות, וביטוי של חלבונים תחת שני היזמים T7-ואנדוגני. 6,8 מודלים מתמטיים נלווים זמינים. 9,10 המערכת וכתוצאה מכך יש לו יישומים ייחודיים בביולוגיה סינתטית כסביבת prototyping, או &quot;TX- קרש חיתוך biomolecular TL. &quot;

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום<em&gt; חיידקי Escherichia</emמערכת&gt; בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...