Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
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हम इस परियोजना के प्रारंभिक दौर में सहायता के लिए Jongmin किम, दान Siegal-Gaskins, अनु Thubagere, और प्रोटोकॉल को व्यवस्थित बनाने के सहायता के लिए हनोक Yeung, और क्लेयर चेन और बार्कले ली धन्यवाद. इस सामग्री के रहने ढलाई कार्यक्रम, अनुबंध संख्या HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS भी एक यूसीएलए / कैलटेक चिकित्सा वैज्ञानिक द्वारा समर्थित है रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA / एमटीओ) द्वारा भाग में समर्थित काम पर आधारित है प्रशिक्षण कार्यक्रम फैलोशिप और से एक DoD, वैज्ञानिक अनुसंधान, राष्ट्रीय सुरक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग में स्नातक (NDSEG) फैलोशिप, 32 सीएफआर 168a की वायु सेना के कार्यालय. इस दस्तावेज़ में निहित विचारों और निष्कर्ष लेखकों के हैं और प्रतिनिधित्व के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए आधिकारिक तौर पर नीतियों, या तो स्पष्ट या निहित, रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी या अमेरिकी सरकार की.

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Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. 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लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

यहाँ वर्णित अंतर्जात कोलाई आधारित TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली डेटा संग्रह करने के लिए सेट से कम से कम आठ घंटे लग सकते हैं कि एक आसान से रन तीन ट्यूब प्रतिक्रिया है. सभी अभिकर्मकों बनाने की प्रक्रिया पांच दिन का समय कुल (केवल एक दिन पर महत्वपूर्ण श्रम आवश्यकताओं के साथ) की आवश्यकता है, लेकिन 3,000 प्रतिक्रियाओं के लिए कच्चे तेल निकालने का उत्पादन और बफर बनाने 10,000 प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों (चित्रा 1). इसके अलावा, कच्चे तेल निकालने और बफर बनाने अभिकर्मकों एक तैयारी के कई उपयोगों के लिए अनुमति देता है, -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 साल के लिए स्थिर रहे हैं. 4 10 μl प्रतिक्रिया $ 0.11 प्रति (श्रम सहित $ 0.26) पर लागत तुलना 98% से कम कर रहे हैं वाणिज्यिक प्रणालियों (चित्रा 2). कुछ अनसुलझे सीमाओं व्यवस्था करने के लिए, हालांकि, कर रहे हैं. प्रत्येक कच्चे तेल की सेल निकालने की तैयारी के अंत दक्षता, उपयोगकर्ता प्रवीणता पर और पर्यावरण की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, हालांकि टीypical उपज भिन्नता 5-10% (चित्रा 4 बी) के बीच है. नतीजतन, दोनों अंत बिंदु अभिव्यक्ति में और अभिव्यक्ति की गतिशीलता में बैच को बैच परिवर्तनशीलता उम्मीद की जानी हैं. निकालने निर्माण पूरी तरह से स्वचालित है जब तक निकालने पूरी तरह से विशेषता या है जब तक इन बदलावों की संभावना बनी रहेगी. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली संवेदनशील मात्रात्मक प्रयोगों का संचालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो यह कच्चे तेल की सेल निकालने का एक ही बैच के साथ सभी प्रयोगों को चलाने के लिए उचित है. एक भी कच्चे तेल की सेल निकालने बैच, के बारे में 3000 प्रतिक्रियाओं से उपज ठेठ प्रयोगात्मक पाठ्यक्रमों के लिए पर्याप्त होना चाहिए. हम विभिन्नता को स्केलिंग और प्रक्रिया स्वचालित द्वारा हटाया जा सकता है पर शक हालांकि, इस तरह के प्रयास पर्याप्त संसाधन निवेश शामिल होगा. अंत बिंदु अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए काफी आसान कर रहे हैं, हालांकि इसके साथ ही, और अधिक काम सेल मुक्त प्रणाली के लिए आंतरिक समझ गतिशीलता में किया जाना चाहिए. यह ज्ञात है कि संसाधन competitio दोनोंn और संसाधन सीमा अभिव्यक्ति की गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, सीमित अंतर्जात सिग्मा 70. 9,27 हालांकि, गतिशीलता पूरी तरह से प्रणाली का उपयोग करने के लिए समझा जा नहीं करना पड़ेगा वृद्धि की डीएनए टेम्पलेट न्यूक्लियोटाइड या अमीनो एसिड की कमी के उस के अनुरूप एक अभिव्यक्ति प्रोफाइल के उत्पादन के साथ एक saturating शासन में परिणाम कर सकते हैं. उपज की शुद्ध वृद्धि के लिए, अनुकूलन मशीन सीखने के दृष्टिकोण से किया जा सकता है. संसाधन प्रतियोगिता और सीमा के 28 प्रश्न प्रयोगात्मक डेटा का उपयोग कर सत्यापित गणितीय मॉडल से संबोधित किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक BL21-Rosetta2 तनाव के लिए अनुकूलित किया है, लेकिन अन्य ई. को generalizable है कोलाई उपभेदों. ऐसे जीन एन्कोडिंग लंदन प्रोटीज और दुर्लभ tRNAs जीन एन्कोडिंग के अलावा को हटाने के रूप में BL21-Rosetta2 में संशोधन, अधिक से अधिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं. हम दो अन्य निकालने उपभेदों के साथ प्रोटोकॉल का प्रयास किया है - केवल BL21 और एक BL21 trxA पीटकर-एकडी में 50% कम प्रोटीन उपज पाया. हम अन्य उपभेदों का उपयोग करते समय पैदावार इसी कमी परिकल्पना है कि. ऐसे लेग और अन्य अमीर बतख के लिए 2xYT मध्यम विकास स्विचन के रूप में मानकों, में अन्य परिवर्तन कमी आई है, प्रोटीन उपज में हुई है. अंतर्जात और exogenous प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी और विनियमन तंत्र दोनों का उपयोग सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों प्रोटीन और metabolite अभिव्यक्ति दोनों में और सिंथेटिक जीव विज्ञान में व्यापक आवेदन किया है. इसके बजाय T7 विनियमित सर्किट को सीमित किया जा रहा है, एक जटिल biomolecules उत्पादन की कल्पना कर सकते हैं 3,29 देशी ई. का एक मिश्रण का उपयोग कर एक उपयोगकर्ता चलाया सेटिंग में कोली प्रमोटरों और exogenously आपूर्ति प्रतिलेखन और विनियमन तंत्र. कोशिका विभाजन और चयापचय की सीमाओं के बिना, इस तरह के repressilator या ऐसे उन उत्पादन आर्टीमिसिनिन के रूप में चयापचय इंजीनियर रास्ते में ही सिंथेटिक सर्किट में परिवर्तनशीलता कम या बेहतर समझा जा सकता है. 30,31 हम हवलदारई आनुवंशिक स्विच को लागू करने के लिए, साथ ही सिग्मा कारक ज़ब्ती समझने के लिए इन फायदों का इस्तेमाल किया 9,32 इस तरह की तकनीक भी &quot;कम से कम&quot; या &quot;कृत्रिम&quot; कोशिकाओं की रीढ़ फार्म कर सकते हैं. - छोटे, अच्छी तरह से विशेषता और आत्मनिर्भर सन्निहित इकाइयों निकालने. 33,34 अंत में, हम सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक प्रोटोटाइप वातावरण के रूप में इस अंतर्जात सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का तत्काल उपयोग करता है आशा. बुनियादी प्लाज्मिड, रैखिक, या रासायनिक synthetized डीएनए परीक्षण के चक्र का पालन - उपनाम &quot;TX-टीएल biomolecular breadboard,&quot; सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली प्रोटोटाइप के दौर से गुजरना कर सकते सिंथेटिक सर्किट अंततः vivo में अभिव्यक्ति के लिए किस्मत में जहां एक चलाया हुआ वातावरण प्रदान करता है विश्लेषण और तेजी से संशोधन के द्वारा. प्रोटोटाइप दौर वर्तमान में विकसित किया जा रहा है भविष्य कहनेवाला गणितीय मॉडलों के द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है. क्लोनिंग और गैर अंतिम सर्किट के लिए विवो हेरफेर में दूर करके, हम इंजीनियरों की आशाneering समय चक्र के बजाय मौजूदा सप्ताह &#39;मानक के 1-3 दिनों तक कम किया जा सकता.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी T7 जीवाणुभोजी डीएनए का उपयोग कर युग्मित प्रतिलेखन अनुवाद तंत्र धरना साल बाद आगे बढ़ाने, विशुद्ध रूप से translational के रूप में 1950 के दशक में शुरू हुआ. 11,12 तब से, कई प्रयासों कच्चे तेल की सेल निकालने का सृजन (या ई अनुकूलन करने के लिए बनाया गया है . कोलाई S30 निकालने). 13,14 इन अनुकूलन एटीपी उत्थान या तनाव संशोधनों के माध्यम से कोशिका मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के समय को बढ़ाने, और प्रोटोकॉल के समय और लागत को कम करने में शामिल हैं. 15-17 वैकल्पिक सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम मौजूद है कि कच्चे तेल की एवज में इस्तेमाल के पुनर्गठन घटकों अभिव्यक्ति के लिए सेल निकाल सकते हैं. 5 क्रूड सेल निकालने और पुनर्गठन तरीकों दोनों वाणिज्यिक उपयोग के लिए विकसित किया गया है. सिंथेटिक जीव विज्ञान के आगमन के साथ, इंजीनियर जैविक मॉड्यूल और सर्किट का परीक्षण करने और व्यक्त करने के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता मंच के लिए एक वृद्धि की जरूरत है. 18,19 इस मंच होना चाहिएबहुमुखी अच्छी तरह से विशेषता, हेरफेर करने के लिए सरल है, और उपयोगकर्ता की आपूर्ति घटकों पर ध्यान केंद्रित किया. आधी सदी पहले विकसित होने के बावजूद, सेल मुक्त प्रणालियों ई. पर आधारित वे विकास और चयापचय की जटिलता के बिना सेलुलर प्रक्रियाओं के इन विट्रो प्रतिनिधित्व में एक सरल रूप में कोली आंतरिक रूप से, इन आवश्यकताओं को साझा करें. इसके अतिरिक्त, ई. पर विवो काम में से मूलभूत ज्ञान के सभी कोलाई ई. को आसानी से लागू होता है कोली सेल मुक्त प्रणाली. सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम सबसे सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों का लक्ष्य आज तक, सिंथेटिक जीव विज्ञान में आवेदन कर सकते हैं हालांकि प्रोटीन और metabolite उपज को अधिकतम कर दिया गया है. इस T7 प्रमोटरों द्वारा संचालित दृश्यों के T7 जीवाणुभोजी प्रतिलेखन का उपयोग करके पूरा किया है. 20 अभिव्यक्ति कुशल और मजबूत है, इन प्रणालियों एक अति विशिष्ट उद्देश्य की सेवा. सेल विनियमन तरीकों सीमित हैं, लक्ष्य डीएनए टेम्पलेट्स होना चाहिएT7 प्रमोटरों शामिल करने के लिए reengineered, और इस तरह के ribosomal परिसरों के रूप में कुछ दृश्यों के लिखित और इकट्ठे नहीं किया जा सकता. 21,22 मौजूदा सेल से मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम अंतर्जात विनियामक तंत्र, सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए आवश्यक एक बहुमुखी प्रतिभा के संरक्षण, जबकि उच्च पैदावार बनाए रखने में असमर्थ हैं. हम एक अंतर्जात ई. विकसित किया है पिछले प्रणाली द्वारा प्रदर्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति की दक्षता को बरकरार रखता है, लेकिन अनुमति देकर अतिरिक्त बहुमुखी प्रतिभा कहते हैं कि कोलाई सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली अभिव्यक्ति और (T7 या अन्य) तंत्र अंतर्जात और exogenous दोनों पर आधारित विनियमन. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मूल रूप से. Kigawa एट अल के आधार पर (2004) और लियू एट अल. (2005), लेकिन महत्वपूर्ण संशोधन किया है. यह वृद्धि की दक्षता के लिए मिलीग्राम और कश्मीर एसीटेट से अधिक मिलीग्राम और कश्मीर ग्लूटामेट का इस्तेमाल 2-mercaptoethanol निकालता है, और एक मनका डिब्बा का उपयोग कोशिकाओं lyses. 17,23,24 मनका पिटाई homogenization पर चुना जाता है,कारण प्रतिस्पर्धा प्रणालियों को अपनी कम लागत और तुलनीय पैदावार के लिए दबाव आधारित विधियों, या sonication. 23 3 phosphoglyceric एसिड (3 पीजीए) यह creatine फॉस्फेट की तुलना में जब बेहतर प्रोटीन पैदावार दे पाया था के रूप में ऊर्जा के स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है phosphoenolpyruvate. 4,25 हमारे सिस्टम या तो लैम्ब्डा-फेज ऑपरेटरों के साथ एक sigma70 आधारित प्रमोटर या अन्य वाणिज्यिक प्रणालियों से पैदावार करने के लिए इसी तरह की एक T7 संचालित प्रमोटर, का उपयोग संवाददाता प्रोटीन की 0.75 मिलीग्राम / एमएल उत्पादन कर सकते हैं. 4,6 पांच दिन सभी आवश्यक अभिकर्मकों (चित्रा 1) के उत्पादन के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, यह तुलनीय वाणिज्यिक सेल मुक्त प्रणालियों की तुलना में एक 98% लागत में कमी प्रदान करता है - माल की लागत श्रम (चित्रा 2) शामिल के साथ $ 0.26 उगता है जो 10 μl प्रतिक्रिया प्रति $ 0.11 रहे हैं.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

आदर्श सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम सैद्धांतिक रूप से एक इन विट्रो मंच में नियंत्रित. 1 यह एक नियंत्रित तरीके से प्रोटीन और आनुवंशिक सर्किट व्यक्त करने के साथ ही सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक प्रोटोटाइप वातावरण प्रदान करने के लिए के लिए उपयोगी है. 2,3 में एक Vivo में सेलुलर पर्यावरण अनुकरण कर सकते हैं बाद के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, संरक्षित है कि सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम अंतर्जात कोलाई प्रतिलेखन अनुवाद तंत्र और अधिक सही T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रतिलेखन के आधार पर उन लोगों की तुलना में vivo सेलुलर गतिशीलता को प्रतिबिंबित करने में सक्षम हैं. हम एक कुशल अंतर्जात ई. की तैयारी और क्रियान्वयन का वर्णन इसी तरह की वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए एक 98% लागत में कमी पर T7 आधारित प्रणाली के रूप में प्रोटीन के बराबर मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं कि कोलाई आधारित प्रतिलेखन अनुवाद (सीए-टीएल) सेल से मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली. 4,5 buffers और कच्चे तेल की सेल निकालने की तैयारी कर रहे हैं एक का निष्पादन, साथ ही वर्णिततीन ट्यूब TX-टीएल प्रतिक्रिया. पूरे प्रोटोकॉल तैयार करने के लिए पांच दिन लगते हैं और एक तैयार करने में 3000 एकल प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त सामग्री पैदावार. एक बार तैयार, प्रत्येक प्रतिक्रिया डेटा संग्रह और विश्लेषण करने के लिए सेटअप से 8 घंटे के तहत लेता है. ई. के लिए विनियमन और प्रतिलेखन एक्सोजेनस के तंत्र कोली, ऐसे लाख / TET repressors और T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के रूप में, पूरक हो सकता है. ऐसे mRNA और डीएनए गिरावट दरों के रूप में 6 अंतर्जात गुण, भी समायोजित किया जा सकता है. 7 TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए प्रदर्शन किया गया बड़े पैमाने सर्किट विधानसभा, जैविक घटना की खोज, और दोनों T7 और अंतर्जात प्रमोटरों के तहत प्रोटीन की अभिव्यक्ति. 6,8 उनके साथ गणितीय मॉडल उपलब्ध हैं. 9,10 जिसके परिणामस्वरूप प्रणाली एक प्रोटोटाइप वातावरण के रूप में सिंथेटिक जीव विज्ञान में अद्वितीय आवेदन किया है, या &quot;TX- टीएल biomolecular breadboard. &quot;

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Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

इस पांच दिवसीय प्रोटोकॉल सभी कदम, उपकरण, और आधारित एक कुशल अंतर्जात कोलाई खरोंच से सीए-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली बनाने और चलाने के लिए आवश्यक पूरक सॉफ्टवेयर रूपरेखा. अभिकर्मकों के साथ, प्रोटोकॉल 8 सेटअप करने के लिए घंटे या उससे कम एक प्रतिक्रिया, जमा है, और प्रक्रिया डेटा लेता है.

एक को लागू करने के लिए प्रोटोकॉल<em&gt; कोलाई</emसिंथेटिक बायोलॉजी के लिए&gt; आधार TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

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Biology

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The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...