Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
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私たちは、プロジェクトの初期段階での支援をJongminキム、ダン·シーガル·ガスキンズ、アヌThubagere、およびプロトコルを効率化支援のためのエノクヨン、そしてクレアチェンとバークレーリーに感謝します。この材料は、米国防総省の国防高等研究計画庁（DARPA /受注生産）生活ファウンドリプログラム、契約番号HR0011-12-C-0065（DARPA / CMO.ZZSもUCLA /カリフォルニア工科大学医学者によってサポートされていることによって部分的にサポートされる作業に基づいています国防総省、空軍科学研究局、国防科学工学専攻（NDSEG）フェローシップ、32のCFR 168Aによるトレーニングプログラムの親睦と。本書に記載されているビューと結論は著者のものであると表現するものと解釈すべきではない米国防総省の国防高等研究計画庁や米国政府の正式の政策、いずれか明示または黙示、。

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. 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Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. 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Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. 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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明する内在大腸菌ベースTX-TL無細胞発現系は、データ収集まで設定からわずか8時間かかることが簡単に実行3管の反応である。すべての試薬 ​​を作成するプロセスは、5日間の時間の合計（一日だけに大きな労力が要求される）を必要としますが、3000反応に粗抽出物を生成し、バッファ意思万反応のための試薬 ​​（ 図1）。さらに、粗抽出物およびバッファ意思試薬は1準備の複数の用途を可能にし、-80℃で少なくとも1年間安定している。4を 10μlの反応あたり0.11ドル（労働を含む0.26ドル）で、コストが同等の98％以上低い商用システム（ 図2）。 いくつかの未解決の制限は、システムに、しかし、存在する。各粗細胞抽出物調製の端効率は、ユーザの習熟度に、環境条件に基づいて変化し得るもののトンypical収量の変動を5〜10％（ 図4b）の間にある。その結果、両方のエンドポイントでの発現および発現動態におけるバッチ間変動性が予想される。抽出液の作成が完全に自動化されるまで、抽出物を完全に特徴づけされるまで、またはこれらの変化は、おそらく残ります。無細胞発現系が敏感な定量的な実験を行うために使用する場合は、粗細胞抽出物の同じバッチですべての実験を実行することをお勧めします。シングル粗細胞抽出物のバッチからの収率、約3000の反応は、典型的な実験のコースで十分です。我々は変化がスケールアップし、処理を自動化することにより除去することができる疑いがあるが、このような試みは、実質的な資源投資を伴うだろう。 エンドポイントの発現レベルを決定するために合理的に容易であるが、さらに、より多くの作業が無細胞系に固有の理解の動態で行われる必要がある。ことが知られているリソースの両方competitionおよびリソース制限が発現動態に影響を与えることができる。例えば、限られた内因性のシグマ70が増大DNAテンプレートは、ヌクレオチドまたはアミノ酸枯渇のものと類似の発現プロファイルを生成して飽和レジームをもたらすことができる。9,27が、動力学は完全にシステムを利用すると理解されるべきではない。収率の純粋な増大のために、最適化は、機械学習の手法によって行うことができる。リソース競合限定の28の質問は、実験データを用いて検証数学的モデルによって対処することができる。 ここで紹介するプロトコルは、BL21-Rosetta2株に最適化されたが、他のEに一般化されている大腸菌株 。このような遺伝子をコードする経度プロテアーゼおよび稀なtRNAをコードする遺伝子の付加の除去などBL21-Rosetta2における修飾は、最大のタンパク質産生を可能にする。我々は2つの他の抽出株とプロトコルを試みている-だけBL21およびBL21 のTrxAノックアウト -ANをDは50％少ないタンパク質収量を発見した。私たちは、他の株を使用する際に歩留まりが同様に減少すると仮定した。例えば、LB及びその他のリッチブロスのための2×YT増殖培地を切り替えるなどのパラメータにおける他の変化は、減少したタンパク質収量をもたらした。 内因性および外因性の転写-翻訳機構と制御機構の両方を利用する無細胞発現系は、タンパク質および代謝産物発現の両方において、合成生物学の広い用途を有する。代わりT7-調節回路に限定されるもので、一つは、複雑な生体分子を産生想定することができる3,29ネイティブEのミックスを使用して、ユーザ制御可能な設定で大腸菌プロモーターおよび外因的に供給転写および規制のメカニズム。細胞分裂および代謝の制限なしに、そのようなアルテミシニンの製造業者などrepressilator合成回路内または代謝の変動操作された経路を減少またはより良く理解することができる。30,31私たちは海Eは、遺伝子スイッチを実装するだけでなく、シグマ因子の隔離を理解するために、これらの利点を使用9,32このような技術は、「最小」または「人工」のセルのバックボーンを形成することができます- 。小さな、十分に特徴づけられたとの自給自足型身体ユニットエキス。33,34 最終的には、合成生物学のためのプロトタイピング環境として、この内因性の無細胞発現系の即時利用を期待しています。基本的なプラスミド、線形、または化学的に合成さDNA上のテストのサイクル、続く-の愛称「TX-TL生体分子ブレッドボード、「無細胞発現系は、プロトタイピングのラウンドを受けることができる合成回路は、最終的にはin vivo発現宛て制御可能な環境を提供します分析と迅速な修飾による。プロトタイピングのラウンドは、現在開発中の予測数学モデルによって支援することができます。非最終回路のためのクローニングおよびインビボ操作を除去することにより、我々は縁起を予想エンジニアリングサイクル時間ではなく、現在の週の標準1-3日に短縮される。

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

無細胞発現技術は、T7バクテリオファージDNAを用いて、結合された転写翻訳機構を包含する年後に進んで、純粋に並進として1950年に始まった。11,12それ以来、数々の努力が粗細胞抽出物の作成 ​​（またはEを最適化するために行われてきた大腸菌 S30抽出物）。13,14これらの最適化は、ATPの再生又は歪みの修正を介して無細胞タンパク質合成を延長し、プロトコルの時間とコストを低減することが挙げられる。15-17代替の無細胞発現系が存在し、その粗製の代わりに使用する再構成成分発現のための細胞抽出物。5粗細胞抽出物および再構成の両方の方法は、商業用に開発されてきた。 合成生物学の出現により、生物学的なモジュール、および回路設計のテストと表現する十分に特徴付けられたプラットフォーム用の増加が必要とされている。18,19このプラットフォームは、である必要があります、汎用性の高い、十分に特徴付けられ、操作が簡単で、ユーザが指定するコンポーネントに焦点を当てた。半世紀以前に開発されているにもかかわらず、無細胞系は、 大腸菌に基づく彼らは成長と代謝の複雑ずに細胞プロセスのインビトロでの表現に簡略化されているように大腸菌は、本質的に、これらの要件を共有しています。さらに、E.上の生体内作業での基礎知識のすべて大腸菌は、大腸菌に容易に適用されます大腸菌無細胞系。 無細胞発現系は、ほとんどの無細胞発現系の目標を現在までに、合成生物学での用途を持つことができますが、タンパク質や代謝物収量の最大化されています。これは、T7プロモーターによって駆動される配列のT7バクテリオファージ転写を用いることによって達成される。20発現が、 ​​効率的かつ堅牢であるが、これらのシステムは高度に特殊目的を果たす。細胞調節方法は限られている、標的DNAテンプレートは、でなければならないT7プロモーターを含むように再設計し、リボソーム複合体のような特定の配列が転写され、組み立てることができない。21,22既存の無細胞発現系は、内因性の調節機構、合成生物学のために必要な汎用性を維持しながら高い収率を維持することができない。 私たちは、内因性Eを開発しました従来のシステムで実証タンパク質発現の効率を維持しますが、内因性および外因性（T7または他の）メカニズムの両方に基づく発現および調節を可能にすることにより、追加の融通性を付加した大腸菌無細胞発現系。ここで説明するプロトコルは、もともと。木川らもとにして（2004）、Liu ら （2005）が、有意な修飾を有している。それは、効率向上のためのMg-およびK-アセテート上でのMg-およびK-グルタミン酸を利用し、2 -メルカプトエタノールを除去し、ビーズビーターを用いて細胞を溶解する。17,23,24ビーズ-鼓動が均質化を介して選択され、圧力ベースの方法、又はによる競合システムに対するその低コストと同等の収率を超音波処理23 3 -ホスホグリセリン酸（3-PGA）がクレアチンリン酸と比較した場合に優れたタンパク質収量を与えることが見出されたように、エネルギー源として使用され、ホスホエノールピルビン酸。4,25私たちのシステムは、他の商用システムからの収量と同様ラムダファージ事業者とシグマ70ベースのプロモーターまたはT7駆動のプロモーターのいずれかを使用して、レポータータンパク質の0.75 mg / mlの最大生成することができます。4,6 5日すべての必要な試薬（ 図1）を生成するために必要とされる。また、同等の商用無細胞系に比べて98％のコスト削減を提供します-材料費が（ 図2）に含ま労働で0.26ドルに上昇し10μL反応あたり0.11ドルである。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

理想的な無細胞発現系は、理論的には体外プラットフォームでも、管理環境下でのin vivo細胞環境をエミュレートすることができます。1これは制御された方法でタンパク質や遺伝子回路を表現するためだけでなく、合成生物学のためのプロトタイピング環境を提供するのに有用である。2,3後者の目的を達成するために、保存する無細胞発現系は、内在大腸菌転写翻訳機構はより正確にT7 RNAポリメラーゼ転写に基づくものよりインビボ細胞動態を反映することができる。我々は、効率的な内因性Eの準備と実行を記述する同じような商用システムへの98％のコスト削減にT7ベースのシステムのようなタンパク質の等量を生成することができ、大腸菌ベースの転写-翻訳（TX-TL）の無細胞発現系。4,5バッファと粗細胞抽出物の調製であるの実行だけでなく、記載され3チューブTX-TL反応。プロトコル全体を準備するために5日かかると1準備で最大3000の単一反応のための十分な材料が得られます。準備された後、各反応は、データ収集と分析のセットアップから8時間の下になります。 Eに規制および転写外因性のメカニズムこのようなラック/ tetリプレッサーおよびT7 RNAポリメラーゼのような大腸菌を 、補充することができる。例えば、mRNAおよびDNAの分解速度などの6内因性特性をも調整することができる。7 TX-TL無細胞発現系は、大について実証されている規模回路組立、生物学的現象を探求し、両方のT7-と内因性プロモーターの下でタンパク質の発現。6,8付随数学モデルが用意されています。9,10結果のシステムは、プロトタイピング環境のような合成生物学のユニークなアプリケーションを持っている、または「TX- TL生体分子ブレッドボード。 &quot;

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Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

この5日間のプロトコルは、すべての手順、機器、およびベースの効率的な内在大腸菌ゼロからTX-TLの無細胞発現系を作成し、実行するために必要な追加ソフトウェアの概要を説明します。試薬を用いて、プロトコルは8セットアップ時間以下の反応、収集、およびプロセスデータをとる。

実装するためのプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための&gt;に基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

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細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

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エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

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ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系<em&gt;マラリア原虫</em&gt; Rhoptryタンパク質

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込み<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;無細胞転写翻訳システム

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...