Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
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우리는 프로젝트의 초기 단계에서 지원을 Jongmin 김, 댄 Siegal-Gaskins, 아누 Thubagere 및 프로토콜을 간소화 도움 에녹 영, 클레어 첸과 바클레이 리 감사합니다. 이 물질은 생활 파운드리 프로그램, 계약 번호 HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS 또한 UCLA / Caltech의 의료 과학자 지원하는 방위 고등 연구 계획국 (DARPA / MTO)에 의해 부분적으로 지원 작업을 기반으로합니다 교육 프로그램의 교제에 의해 국방부, 과학 연구, 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 원정대, 32 CFR의 168A의 공군 사무실은.이 문서에 포함 된 전망과 결론은 저자의 사람입니다과은 대표로 해석 할 수 없습니다 공식적으로 정책을 명시 적 또는 묵시적, 방위 고등 연구 프로젝트 기관 또는 미국 정부의.

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Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. 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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 내생 대장균 기반 TX-TL 무 세포 발현 시스템은 데이터 수집에 설정에서 여덟 개 미만의 시간이 걸릴 수 있습니다 쉬운 실행 세 튜브 반응이다. 모든 시약을 만드는 과정은 오일의 시간 합계 (하루 만에 상당한 노동 요구 사항)를 필요로하지만, 3000 반응에 조 추출물을 생산하고 버퍼 만들기 만 반응 시약 (그림 1). 또한, 조 추출물 및 버퍼 결정 시약 한 준비의 여러 사용을 허용, -80 ° C에서 1 년 이상 안정적이다. 4를 10 ㎕의 반응 당 $ 0.11 (노동을 포함하여 $ 0.26)에서, 비용은 비교 98 % 감소 상용 시스템 (그림 2). 몇 가지 해결되지 않은 제한 사항이 시스템에, 그러나,이 있습니다. 각 조 세포 추출물 제제의 단부 효율, 사용자 능력에, 환경 조건에 따라 달라질 수 있지만 typical 수율의 변화는 5 ~ 10 % (그림 4B) 사이에있다. 결과적으로, 두 종점 발현 및 발현 역학 뱃치 간 변이가 예상하여야한다. 추출물의 생성이 완전 자동화 될 때까지 추출이 완전히 특징이나 될 때까지 이러한 변화는 가능성이 남아 있습니다. 무 세포 발현 시스템은 민감한 정량 실험을 수행하는 데 사용되는 경우, 조 세포 추출물의 동일한 배치로 모든 실험을 실행하는 것이 바람직하다. 하나의 원유 세포 추출물 배치, 약 3000 반응의 수율은 일반적인 실험 과정에 대한 충분합니다. 우리는 편차가 스케일링 및 절차를 자동화함으로써 제거 될 수있다 의심하지만, 이러한 시도들은 상당한 자원 투자를 수반한다. 종점 발현 수준을 결정하게 합리적 쉽지만 또한, 많은 작업이 무 세포계 본질적인 이해 역학에서 수행 될 필요가있다. 그것은 알려져 그 자원 competitio 모두n 및 자원 제한은 표현의 역학 관계에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 제한된 내인성 시그마 70. 9,27하지만, 역학 시스템을 충분히 활용하는 것으로 이해되지 않아도 증가 DNA 템플릿은 뉴클레오티드 또는 아미노산 고갈 된 것과 유사한 발현 양상을 생산하는 포화 정권 초래할 수있다. 수율의 순수한 증가를 위해, 최적화 기계 학습 방법에 의해 수행 할 수 있습니다. 자원 경쟁과 제한의 28 문제는 실험 데이터를 사용하여 확인 수학적 모델에 의해 해결 될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 BL21-Rosetta2 변형에 최적화 된, 그러나 다른 E.에 일반화입니다 대장균의 변종. 이러한 유전자 부호화 LON 프로테아제 희귀 된 tRNA를 코딩하는 유전자의 첨가의 제거와 같은 BL21-Rosetta2의 변형은, 최대한의 단백질 생산을 허용한다. 우리는 다른 두 개의 추출 균주 프로토콜을 시도했다 - 만 BL21과 BL21 trxA의 녹아웃을D는 50 % 미만의 단백질 수율을 발견했다. 우리는 다른 균주를 사용하는 경우 수익률이 유사하게 감소한다는 가설을 세웠다. 이러한 LB 및 기타 풍부한 국물에 2xYT 성장 매체를 전환과 같은 매개 변수, 다른 변화는 감소 단백질 수율에 성공. 내인성 및 외인성 전사 - 번역 기계 및 규제 메커니즘을 모두 활용 한 무 세포 발현 시스템은 단백질과 대사 산물의 표현 모두에서 합성 생물학의 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 대신 T7 조절 회로에 한정되는 것이, 하나는 복잡한 생체 분자를 생산하는 구상 할 수 3,29 E. 고유의 혼합을 사용하여 사용자 환경에서 제어 가능한 대장균의 발기인 및 외생 적 공급 전사 및 규제 메커니즘. 세포 분열과 신진 대사의 제한없이, 이러한 repressilator 또는 그 생산 아르테 미시 닌으로 대사 공학 경로에서 같은 합성 회로의 변동성이 감소하거나 더 잘 이해 될 수있다. (30, 31) 우리는 근래전자는 유전 적 스위치를 구현하기 위해,뿐만 아니라 시그마 인자 격리을 이해하는 이러한 장점을 이용 9,32 이러한 기술은 또한 &quot;최소한의&quot;또는 &quot;인공&quot;세포의 골격 형성 할 수있다 -. 작은, 잘 특성화와의 자급 자족 내재 단위 추출물. 33, 34 궁극적으로, 우리는 합성 생물학의 프로토 타입 환경 등이 내인성 무 세포 발현 시스템의 즉각적인 사용을 기대하고 있습니다. 기본 플라스미드, 선형, 또는 화학적으로 synthetized DNA에 대한 검사의주기, 다음 - 별명 &quot;TX-TL 생명 브레드,&quot;무 세포 발현 시스템은 프로토 타입의 라운드를받을 수 합성 회로가 궁극적으로 생체 내 발현을 대상으로 제어 환경을 제공합니다 분석과 신속한 수정에 의해. 프로토 타이핑 라운드 현재 개발되고 예측 수학적 모델에 의해 도움을받을 수 있습니다. 복제 비 최종 회로에 대한 생체 조작에서 제거함으로써, 우리는 공학부 예상니어링 사이클 시간 대신 현재 주 &#39;기준 1-3 일로 단축된다.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

세포 자유로운 표현 기술은 T7 박테리오파지 DNA를 사용하여 결합 전사 - 번역의 메커니즘을 포함하는 년 후 발전, 순수하게 번역으로 1950 년에 시작되었다. 11, 12, 그 이후로, 수많은 노력은 원유 세포 추출물의 창조 (또는 E를 최적화되었습니다 . 대장균 S30 추출물). (13, 14) 이러한 최적화는 ATP 재생 또는 변형 수정을 통해 세포 단백질 합성을 연장하고, 프로토콜의 시간과 비용을 줄일 수 있습니다. 15-17 대체 무 세포 발현 시스템이 존재하는 원유 대신에 사용 재구성 구성 요소 표현 세포 추출물. 5 조 세포 추출물과 재구성 방법은 모두 상업적 목적으로 개발되었다. 합성 생물학의 출현과 함께, 설계 생물학적 모듈과 회로를 테스트하고 표현할 수있는 잘 특성화 플랫폼을위한 증가 필요가있다. 18, 19이 플랫폼이어야합니다다목적 잘 특징, 조작이 간단하고, 사용자가 제공 한 구성 요소에 초점을 맞추었다. 반세기 이전의 개발에도 불구하고, 세포가없는 시스템은 E.에 근거 그들은 성장과 신진 대사의 복잡성없이 세포 프로세스의 체외 표현의 단순화로 대장균은 본질적으로, 이러한 요구 사항을 공유 할 수 있습니다. 또한, E.에 생체 내 작품에서 기초 지식의 ​​모든 대장균 E.에 쉽게 적용 대장균 세포없는 시스템. 무 세포 발현 시스템은 대부분의 무 세포 발현 시스템의 목표를 지금까지 합성 생물학에 응용 프로그램이있을 수 있지만 단백질과 대사 산물의 수율을 극대화하고있다. 이것은 T7 프로모터에 의해 구동 시퀀스의 T7 박테리오파지의 전사를 사용하여 수행됩니다. 20 표현이 효율적이고 강력하지만, 이러한 시스템은 고도로 전문화 된 목적을 제공하고 있습니다. 셀 규제 방법이 제한되어 대상 DNA 템플릿을해야합니다T7 프로모터를 포함하도록 재 설계하고, 이러한 리보솜 단지 특정 시퀀스가 전사 및 조립 할 수 없습니다. (21, 22) 기존의 무 세포 발현 시스템은 내생 규정하는 기계, 합성 생물학에 필요한 기능성을 유지하면서 높은 수율을 유지할 수 없습니다. 우리는 내생 E.을 개발했습니다 이전 시스템에 의해 입증 단백질 발현의 효율성을 유지하지만 있도록하여 추가 기능성을 추가 대장균 세포 표현의 자유의 시스템 표현과 (T7 또는 기타) 메커니즘 내인성 및 외인성 양에 따라 조절. 여기에 설명 된 프로토콜은 원래. Kigawa 등을 기준으로 (2004 년)와 리우 등. (2005), 그러나 중요한 수정을 가지고 있습니다. 그것은 효율성 향상을위한 마그네슘과 K-아세테이트 mg 이상 및 K-글루탐산을 활용 2 - 머 캅토 에탄올을 제거하고, 비드 비터를 사용하여 세포를 lyses. 17,23,24 비드 박동이 균질화를 통해 선택,때문에 경쟁 시스템의 낮은 비용과 유사한 수율에 압력 기반의 방법, 또는 초음파는. 23 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA는)이 크레아틴 인산에 비해 우수한 단백질 수율을 제공하는 것으로 확인되었을 때 에너지 원으로 사용된다 포스. 4,25 우리의 시스템은 하나 람다 파지 사업자와 sigma70 기반의 발기인 또는 다른 상용 시스템에서 수익률과 유사한 T7 중심의 프로모터를 사용하여 기자 단백질의 0.75 ㎎ / ㎖을 생성 할 수 있습니다. 4,6 다섯 일 필요한 모든 시약 (그림 1)를 생성해야합니다. 또한, 비교 광고 셀없는 시스템에 비해 98 %의 비용 절감을 제공합니다 - 재료 비용 노동 (그림 2)를 포함으로 $ 0.26로 상승하는 10 ㎕의 반응 당 $ 0.11이다.

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 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

이상적인 무 세포 발현 시스템은 이론적으로 시험관 플랫폼 제어. 1이 통제 된 방식으로 단백질과 유전자 회로를 표현뿐만 아니라, 합성 생물학에 대한 프로토 타이핑 환경을 제공하는 데 유용합니다. 2,3에서 생체 세포 환경을 에뮬레이션 할 수 있습니다 후자의 목적을 달성하기 위해, 보존 무 세포 발현 시스템은 내인성 대장균 전사 - 번역 메커니즘은 더 정확하게 T7 RNA 폴리머 라제 전사에 기초하여보다 생체 세포 역학을 반영 할 수있다. 우리는 효율적인 내인성 E.의 준비 및 실행을 서술 유사한 상용 시스템에 대한 98 %의 비용 절감에 T7 기반 시스템과 같은 단백질의 상당 금액을 생산할 수있는 대장균을 기반으로 전사 - 번역 (TX-TL) 무 세포 발현 시스템. 4,5 버퍼와 원유 세포 추출물의 준비가 의 실행뿐만 아니라, 기재된세 관 TX-TL 반응. 전체 프로토콜을 준비하는 데는 약 5 일이 소요됩니다 한 준비에 최대 3000 단일 반응에 대한 충분한 정보를 얻을 수 있습니다. 일단 준비, 각 반응은 데이터 수집 및 분석 설정에서 8 시간에서 걸립니다. E.에 대한 규제와 전사 외인성의 메커니즘 대장균이 같은 락 / TET의 억제 자와 T7 RNA 중합 효소로 보충 할 수있다. 이러한 mRNA와 DNA의 분해 속도와 같은 6 내생의 속성을,도 조정할 수 있습니다. 7 TX-TL의 무 세포 발현 시스템이 시연 한 대형 규모의 회로 조립, 생물학적 현상을 탐구하고, 모두 T7과 내생 발기인에서 단백질의 발현. 6,8 동반자 수학적 모델을 사용할 수 있습니다. 9,10 결과 시스템은 프로토 타입 환경으로 합성 생물학의 고유 한 응용 프로그램을 가지고, 또는 &quot;TX- TL의 생명 브레드. &quot;

우리는 TX-TL 무 세포 발현 시스템을 기반으로 내인성 대장균의 제조 오일 프로토콜을 제시 하였다. 조 질의 세포 추출물 및 버퍼 - - 시약을 생성하기위한 샘플 타임 라인은도 1에서 찾을 수있다. 일단 생성되면, 이들은 1 년까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 시약을 만든 후, 실험 설정 및 실행은보다 8 시간에 수행 할 수 있습니다. 또, TX-TL의 무 세포 발현 시스템의 발현 조건을 최적화. 이러한 버퍼 또는 DNA 솔루션과 같은 다른 사용자가 제공 한 추가는, 미리 독성 교정해야한다. 예를 들어, 처리 플라스미드의 다른 방법으로 인해 염 함량에 다른 표정을 초래할. 우리는 또한 반응 효율에 트리스로-C1 용출 버퍼의 효과 (그림 5)를 테스트했다. 4.9 단계 4.1 참조 원유 세포 추출물 교정의 예는, 표시됩니다그림 4a에서. 일반적으로, 우리의 실험은 원유 세포 추출물이 K-글루타민산 수준 다음의 Mg-글루타민산 염 수준에 가장 민감하다는 것을 보여줍니다. 무 세포 발현 시스템을 설명하기 위해, 우리는 TET의 억압에 따라 음의 피드백 루프. 26 (그림 6)를 건설하고 시험했다. 무 세포 발현 시스템에서,과 및 ATC없이 동일한 회로 실행 표현 8 시간 후 deGFP 기자의 7 배 엔드 포인트의 표정 변화를 보여줍니다. 그들은 &quot;마스터 믹스 준비.&quot;에 추가 할 수 있습니다 필요한 경우이 실험은, 세계 유도 또는 억제 자이 필요하지 않지만 <img alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> 그림 1. 조 질의 세포 추출물, 아미노산 용액, 에너지 용액 제조를위한 타임 라인. 5 일간 timelin<html> 프로토콜의 일반적인 실행을위한 전자 밤새 배양 및 주간 작업 단계에 최적화 된, 위 주어진다. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> 그림 2. 비용 및 원유 세포 추출물을 경쟁의 발현 분석. ) TX-TL의 무 세포 발현 시스템의 노동과 재료 비용의 고장. 2012년 12월의 같은 시약의 비용, 시간 당 $ 14 노동 비용을 기준으로합니다. 나) 기타 상용 시스템 대 TX-TL 세포 표현의 자유의 시스템 비용의 비교. 반응 볼륨이 키트 당. C 다른 상용 시스템 대 TX-TL의 무 세포 발현 시스템 수율) 비교 될 수 있지만 비용은 μL 당 분류됩니다. 단백질 발현 수율은 제조사 기준에 의해 결정./ 50762fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> 그림 3. 비드 박동 튜브의 로딩 및 처리. ) 셀 비드 솔루션의 정확한 점도의 데모. 휴대 구슬 솔루션은 얼음에 소요되는 추가 S30A 버퍼의 양, 추가 구슬의 양, 시간 등의 여러 요인에 따라 점도있을 것입니다. B) 비드를 제패 한 튜브의 로딩 빠른 탁상 원심 분리 전에. 원심 분리로드하는 동안 축적 된 거품을 제거합니다. C) 탁상 원심 분리 후 부상 거품. 거품의 크기는 다를 것이다. 그들은 피펫 팁 D를 사용하여 팝 또는 제거 할 수 있습니다) 완전히 채워 비드를 제패 한 관을 씌우는 전에. 메 니스 커스가 비드 박동 t 형성된다우베 및 모자). 전자를 너무 많이 넣다 올바르게로드 필터 장치를 적은 양을 커버 일으킬 정도로 있습니다. 이 올바르게 대를 잘못 처리 비드를 제패 한 튜브. F) 비교를 재사용 할 수 있습니다. 왼쪽의 관은 잘 비트 튜브 - 그것은 작고 잘 묘사 꼭대기 층, 매우 명확 상층 액을 갖추고 있습니다. 좌측 관은 클수록 불투명 층과 제 흐릿한 상등액을 기반으로, 차선이다. 차선 있습니다 튜브는 계속 처리 할 수​​ 없습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> 그림 4. 조 추출물 제제의 속성. ) 원유 세포 추출물에 대한 일반적인 교정 플롯. 조 추출물은이 순서대로, 추가의 Mg-글루타메이트, K-글루타메이트, 및 DTT 농도에 대해 교정된다. 엔드 포인트 fluorescenc은 표시E 8 시간뿐만 아니라, 12 분 이동 평균에 기초하여 단백질 생산의 최대 비율 후. 이러한 플롯에 기초하여, 추가의 Mg-글루타메이트의 허용 범위는 K-글루타메이트가 60-80 ㎜ 인, 4 mm로하고, DTT는 0-3 ㎜이다. 모든 조 추출물이 세 변수에 독립적으로 보정해야합니다. B) 추출물 제제의 변화. 다른 날짜에 준비 두 원유 추출물의 엔드 포인트 형광 표시되고, 오차 막대는 서로 다른 일에 세 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> 그림 5. 발현 효율에 DNA 용액의 효과. 두 개의 서로 다른 정화의) 비교플라스미드를 처리하기위한 방법. pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500의 1 nM의는 QiaPrep 스핀 미니 프렙 키트 (정화 방법 1) 또는 제품, QIAquick PCR 정제 키트와 후 처리하여 제조한다 (정화 방법 2). 8 시간뿐만 아니라, 12 분의 이동 평균에 기초하여 단백질 생산의 최대 속도 후의 끝점 형광 도시된다. 오차 막대는 서로 다른 일에 4 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. 용출 버퍼의 B) 효과 (트리스로-C1). 트리스로-C1의 다른 농도 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500의 1 ㎚의 식을 기반으로 세포 표현의 자유 반응에 비교된다. 주어진 농도는 반응 트리스로-C1의 최종 농도이며 사용 용출 완충액은 10 mM 트리스-Cl 인. 오차 막대는 서로 다른 일에 세 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <p class="jove_content" fo:유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> 그림 6. 음의 피드백 루프의 샘플 TX-TL 실행. a) 샘플 무 세포 실행 반응 셋업. 대 음의 피드백 루프의 &quot;오프&quot;상태, 양성 및 음성 컨트롤. b)는 음의 피드백 루프의 플라스미드지도. C) 대표 결과 &quot;에&quot;테스트합니다. 데이터에서 실험을 반영)와 b), 음성 대조군과 신호에서 제외. 유전자 회로는 삽입에 표시됩니다. 오차 막대는 서로 다른 일에 세 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 집중 </td><td> 양 </td><td> 살균 </td><td> 주의 사항 </td></tr><tr><td> 클로람페니콜 (CM) </td><td> 에탄올에 34 ㎎ / ㎖ </td><td> 1 ㎖ </td><td> 소독 필터 (0.22 μM) </td><td> 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장 더 큰 볼륨을 만들 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + 센티미터 한천 플레이트 </td><td> 31g / L 2xYT, 40 mM의 인산 칼륨 이염, 22 mM의 인산 칼륨 일 염기성, 34 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 </td><td> 1 판 </td><td> 압력솥 </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P 미디어 </td><td> 31g / L 2xYT, 40 mM의 인산 칼륨 이염, 22 mM의 인산 칼륨 일 염기성 </td><td> 4 L </td><td> 압력솥 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 원유 세포 추출 프로토콜의 1 일 용 시약. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 집중 </강한&gt; </td><td> 양 </td><td> 살균 </td><td> 주의 사항 </td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 2 M </td><td> 250 ㎖의 </td><td> 소독 필터 (0.22 μM) 또는 오토 클레이브 </td><td> 상온에서 저장할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ML </td><td> 소독 필터 (0.22 μM) </td><td> 큰 볼륨을 만들어 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> S30A 버퍼 </td><td> 14 밀리미터 밀리그램 - 글루타민산, 60 mM의 K-글루타민산, 50 MM 트리스, 산도 7.7 </td><td> 2 L </td><td> 압력솥 </td><td> pH가 7.7에 도달하기 위해, 아세트산으로 적정한다. 사용 직전에 2 mM의 최종 농도 DTT를 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </td></tr><tr><td> S30B 버퍼 </td><td> 14 밀리미터 밀리그램 - 글루타민산, 60 mM의 K-글루타민산 ~ 5 MM 트리스, 산도 8.2 </td><td> 2 L </td><td> 압력솥 </td><td> pH가 8.2에 도달하기 위해, 2M으로 적정트리스. 사용 직전에 1 mM의 최종 농도 DTT를 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </td></tr></tbody></table> 표 2. 원유 세포 추출 프로토콜의 하루 2 용 시약. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> 매 </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 빈 50 ML 팔콘 (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 펠렛 50 ML 팔콘 (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 펠렛 대용량 (50 ㎖ 펠릿와 팔콘 - 빈 50 ML 팔콘) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 추가 S30A 버퍼 볼륨 (펠렛 질량 * 0.9) (ML) </td><td></TD&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 추가 할 수있는 구슬의 총 질량 (펠렛 질량 * 5.0) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 원유 세포 추출 프로토콜의 일 3 S30A 버퍼와 구슬의 질량 계산기. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 집중 </td><td> 양 </td><td> 살균 </td><td> 주의 사항 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH가 8 </td><td> 4 ML </td><td> 없음 </td><td> pH가 8에 도달하기 위해, KOH로 적정한다. </td></tr><tr><td> 염기 혼합 </td><td> 156 mM의 ATP와 GTP, 94 mM의 CTP 및 UTP, pH를 7.5 </td><td> 1.5 ML </td><td> 없음 </td><td> pH가 7.5에 도달하기 위해, KOH로 적정한다. </td></tr><tr><td> tRNA의 </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td><td> 600 μL </td><td> 없음 </td><td></td></tr><tr><td> CoA를 </td><td> 65 mM의 </td><td> 600 μL </td><td> 없음 </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 밀리미터, pH가 7.5 ~ </td><td> 300 μL </td><td> 없음 </td><td> pH가 7.5에 도달하려면 2 M.에서 트리스으로 적정 </td></tr><tr><td> 캠프 </td><td> 650 밀리미터, pH가 8 </td><td> 200 μL </td><td> 없음 </td><td> pH가 8에 도달하려면 2 M.에서 트리스으로 적정 </td></tr><tr><td> 엽산 </td><td> 33.9 밀리미터 </td><td> 300 μL </td><td> 없음 </td><td> 만 300 μL이 필요하지만, 보충의 조리법은 1.15 ㎖를위한 것입니다. </td></tr><tr><td> 스퍼 미딘 </td><td> 1 M </td><td> 150 μL </td><td> 없음 </td><td> 4 ° C에서 보관은 열 37 ° C에서 녹는. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH를 7.5 </td><td> 3.2 ML </td><td> 없음 </td><td> pH가 7.5에 도달하려면 2 M.에서 트리스으로 적정 </td></tr></tbody></table> 표 4. 에너지 솔루션 프로토콜을 준비하는 시약. 보충 자료 1. 항목의 조리법. 클로람페니콜, 34 ㎎ / ㎖ : 0.51 g의 클로람페니콜을 준비하고 15 ㎖의 에탄올을 추가합니다. 소독 필터 (0.22 μM), 1 ㎖ 튜브, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는. 2xYT + P + 센티미터 한천 플레이트 : 1.24 g 2xYT, 1 M @ 1.6 ml의 인산 칼륨 용액 40 ㎖에 1 M @ 0.88 ㎖의 칼륨 인산 용액, 0.6 g 한천, 물을 준비합니다. 오토 클레이브. 50 ° C로 냉각시켜 40 μL 센티미터를 추가합니다. 나누어지는 25 100 × 15mm 페트리 접시에 ML, 1 시간 동안 식힌다. 2xYT + P 미디어 : 124g 2xYT, 1 M @ 160 ㎖의 인산 칼륨 용액, 4 L. Aliqu 1 M, 물 @ 88 ㎖를 1 인산 칼륨 용액을 준비2 × 1.88 L 0.24 L. 오토 클레이브 속으로 해주 마. 트리스베이스, 2 개의 M이 : 250 ml로 60.57 g 트리스베이스와 물을 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 실온에서 저장을 소독. DTT, 1 M : 15 ml로 2.31 ​​g의 DTT와 물을 준비합니다. 소독 필터 (0.22 μM), 1 ㎖ 튜브, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는. S30A 버퍼 : 10.88 g의 Mg-글루타민산과 24.39 g의 K-글루타민산, 2M, (산도 7.7), 아세트산 50 ㎖의 트리스를 준비, 물 2 L. 오토 클레이브에, 4 ° C에서 저장, 4 ML 1 M DTT를 추가 사용하기 전에. S30B 버퍼 : 10.88 g의 Mg-글루타민산과 24.39 g의 K-글루타민산, 2 M의 트리스 (산도 8.2)를 준비하고, 물 2 L. 오토 클레이브에, 4 ° C에서 보관, 사용하기 전에 2 ㎖ 1 M DTT를 추가합니다. HEPES : 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (산도 8)를 준비하고, 물 4 ㎖를합니다. tRNA의 600 μL에 30의 tRNA의 MG와 물을 준비합니다. CoA를 600 ㎕의 30 CoA를 (MW 767.53)의 MG와 물을 준비합니다. NAD : 300 μL에 (산도 7.5에) NAD의 34.83 밀리그램 (MW 663.43), 2 M에서 트리스를 추가, 물. (산도 7.5에 대한 해결책을 가지고 2 M에서 트리스의 27 μl를 추가합니다). 캠프 : 200 μL에 42.80 캠프의 MG (MW 329.22), 2 M (산도 8)에서 트리스, 물을 추가합니다. (산도 8에 대한 해결책을 가지고 2 M에서 트리스의 73 μl를 추가합니다). 엽산 (33.9 mM)을 : 고체 엽산 칼슘 염 (MW 511.5)의 20 밀리그램, 1.15 ㎖의 물을 추가합니다. 스퍼 미딘 : 150 μL에 23.55 스퍼 미딘 ㎕의 (MW 145.25)과 물을 준비합니다. 37 ° C에서 간단히 녹여 상온에서 준비 3-PGA : 3.2 ml로 1.03 3-PGA (MW 230.02)의 G, (산도 7.5) 2 M에서 트리스, 물을 추가합니다. (산도 7.5에 대한 해결책을 가지고 2 M에서 트리스의 1.73 ML을 추가합니다). NucleotIDE 믹스 : ATP 칼륨 염 수화물의 145 밀리그램 (MW 619.4), GTP의 나트륨 염 133 MG (MW 567.14), CTP 나트륨 염 수화물의 79.4 MG (MW 563.16), UTP의 삼 나트륨 염 수화물의 82.6 MG (MW 586.12)을 추가 1.5 ㎖의 15 % 희석 (산도 7.5), 물에 KOH. (산도 7.5에 대한 해결책을 가지고 15 %의 희석에 KOH의 353 μl를 추가합니다). 보충 자료 2. 브래드 분석. <ol><li> 4 ° C에서 브래드 에이전트를 제거하고 실온에서 설정합니다. </li><li> 1 ㎎ / ㎖에서 0.1 ㎎ / ㎖에서 50 ㎕의 BSA 표준을 준비합니다. </li><li> 단계 1.47에서 추출의 40 μl를 20 배 희석을 준비합니다. </li><li> 7 큐벳에 800 ㎕의 물을 추가합니다. </li><li> 0 ㎎ / ㎖, 1 ㎎ / ㎖ (10 ㎕를 0.1 ㎎ / ㎖ BSA), 2 ㎎ / ㎖ (20 ㎕를 0.1 ㎎ / ㎖ BSA), 4 ㎎ / ㎖ (4 ㎕를 1 ㎎ / ㎖ BSA)에 대한 표준 큐벳 준비 6 ㎎ / ㎖ (10 ㎕를 1 ㎎ / ㎖ BSA). </li><li> 샘플 2 μL 샘플의 4 μL를위한 실험 큐벳을 준비합니다. </li><li> 각 베트 브래드 포드 제 200 μl를 추가하고 B를 잘 섞는다Y 피펫. 적어도 10 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 단계 6.5에서 큐벳을 사용하여 OD 595 nm에서 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선을 거절하는 경우에 R 2 &lt;0.95. </li><li> 단계 6.6에서 큐벳을 사용하여 OD 595 nm에서 추출물의 농도를 결정합니다. </li></ol> 보충 자료 3. 교정 스프레드 시트를 버퍼. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL_e (템플릿) _calibration_JoVE.xlsx를 참조하십시오</a> . 보충 자료 4. 세포 표현의 자유는 스프레드 시트를 실행합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL _JoVE.xlsx를 참조하십시오</a> .

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