Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Vi takker Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, og Enoch Yeung for assistanse effektivisering protokollen, og Clare Chen og Barclay Lee for å få hjelp i en tidlig fase av prosjektet. Dette materialet er basert på arbeid støttes delvis av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living støperi program, kontraktsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS er også støttet av en UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program fellesskap og ved en DoD, Air Force Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. Synspunktene og konklusjonene i dette dokumentet er de av forfatterne, og bør ikke tolkes som representerer offisielt politikk, enten uttrykkelig eller underforstått, for Defense Advanced Research Projects Agency eller den amerikanske regjeringen.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Den endogene Escherichia coli basert TX-TL celle-fri ytring system som beskrives her er en lett-å-løp tre tube reaksjon som kan ta mindre enn åtte timer fra satt opp til datainnsamling. Prosessen med å lage alle reagenser krever fem dagers tid totalt (med betydelige arbeidsforbruk på bare én dag), men produserer råolje ekstrakt for 3000 reaksjoner og buffer-making reagenser for 10 000 reaksjoner (figur 1). Videre rå ekstrakt og buffer-making reagenser er stabile i minst ett år ved -80 ° C, noe som åpner for flere bruksområder av en forberedelse. 4 På $ 0,11 per 10 mL reaksjon ($ 0,26 inkludert arbeid), kostnadene er 98% lavere enn sammenlignbare kommersielle systemer (figur 2). Det er noen uløste begrensninger, men til systemet. Slutten effektiviteten av hver råolje celle ekstrakt forberedelse kan variere basert på brukerkompetanse og på miljøforhold, selv om typical utbytte variant er mellom 5-10% (figur 4b). Som et resultat av batch-til-batch-variabilitet i begge end-point uttrykk og i uttrykket dynamikk er å forvente. Disse variasjonene vil trolig forbli inntil ekstrakt er fullstendig karakterisert eller til ekstrakt skapelse er helautomatisk. Hvis den cellefrie ekspresjonssystem blir brukt til å drive sensitive kvantitative eksperimenter, er det tilrådelig å kjøre alle forsøk med den samme batch av rå celleekstrakt. Utbyttet fra en enkelt råolje celle ekstrakt batch, ca 3000 reaksjoner, bør være tilstrekkelig for typiske eksperimentelle kurs. Selv om vi har mistanke om variasjoner kan fjernes ved å skalere opp og å automatisere fremgangsmåten, ville slike forsøk innebære en betydelig ressurs investering. I tillegg, selv om endepunktet uttrykk nivåer er rimelig lett å finne ut, trenger mer arbeid som må gjøres i forståelse dynamikk iboende til cellen fritt system. Det er kjent at både ressurs COMPETITIOn og ressursbegrensning kan påvirke uttrykket dynamikk. For eksempel kan det begrensede endogene sigma 70 resultere i en mette regime med økt DNA-templat som produserer et uttrykk profil analog med den i nukleotid-eller aminosyre-uttømming. 9,27 imidlertid dynamikk trenger ikke å være fullt forstått å utnytte systemet. For rene økning av utbytte, kan optimalisering gjøres maskinelt-læring tilnærminger. 28 spørsmål av ressurs konkurranse og begrensning kan løses ved matematiske modeller verifisert ved hjelp av eksperimentelle data. Protokollen som presenteres her er optimalisert for en BL21-Rosetta2 belastning, men er generaliseres til andre E. coli-stammer. Modifikasjoner i BL21-Rosetta2, slik som fjerning av genet som koder lon proteasen og tilsetning av gener som koder for sjeldne tRNAs, tillate maksimal proteinproduksjon. Vi har forsøkt protokollen med to andre ekstrakt stammer - BL21 bare og en BL21 trxA knockout-end fant 50% mindre protein yield. Vi hypotese at rentene på samme måte redusere ved bruk av andre stammer. Andre endringer i parametere, slik som å bytte 2 x YT vekstmedium for LB og andre rike buljonger, har resultert i redusert proteinmengde. Cell-free ekspresjonssystemer utnytte både endogene og eksogene transkripsjon-oversettelse maskiner og reguleringsmekanismer har brede programmer i både protein og metabolitt uttrykk og i syntetisk biologi. 3,29 i stedet for å være begrenset til T7-regulert kretser, kan man tenke seg å produsere komplekse biomolekyler i et brukerstyrt innstilling ved hjelp av en blanding av innfødte E. coli arrangører og eksogent levert transkripsjon og reguleringsmekanismer. Uten begrensninger av celledeling og metabolisme, kan variasjonen i syntetiske kretser som repressilator eller metabolske veier konstruert slik som de produserende artemisinin reduseres eller bedre forstått. 30,31 Vi have brukte disse fordelene for å gjennomføre genetiske brytere, samt å forstå sigma faktor sequestration 9,32 Slik teknologi kan også danne ryggraden i &quot;minimal&quot; eller &quot;kunstige&quot; celler -. lite, godt karakterisert og selvforsynt legemlig enheter av ekstrakt. 33,34 Til syvende og sist, forventer vi umiddelbare anvendelser av denne endogene celle-frie uttrykk system som en prototyping miljø for syntetisk biologi. Kallenavnet &quot;TX-TL biomolekylære koblingsbrettet,&quot; the cell-free ekspresjonssystem gir et kontrollerbart miljø hvor syntetiske kretser til slutt bestemt for in vivo-ekspresjon kan gjennomgå runder med proto - sykluser av testing på basis plasmid, lineær, eller kjemisk syntetisert DNA, etterfulgt ved analyse og rask endring. Prototyping runder kan bli hjulpet av prediktive matematiske modeller for tiden under utvikling. Ved å fjerne kloning og in vivo manipulasjon for ikke-ferdige kretser, forventer vi engineering syklustider for å bli redusert til 1-3 dager i stedet for dagens ukers standard.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Cell-ytringsfrihet teknologi startet i 1950 som rent translasjonsforskning, marsj år senere til å omfatte kombinert transkripsjon-oversettelse mekanismer ved hjelp T7 bakteriofag DNA. 11,12 Siden da har mange anstrengelser er gjort for å optimalisere etableringen av råolje celle ekstrakt (eller E . coli S30 ekstrakt). 13,14 Disse optimaliseringer inkluderer forlenge cellefritt proteinsyntesen gjennom ATP regenerering eller belastningsskader modifikasjoner, og redusere protokoll tid og kostnad. 15-17 Alternative cellefrie ekspresjonssystemer eksisterer som bruker rekonstituert komponenter i stedet for råolje celleekstrakt for ekspresjon. fem Både rå celleekstrakt, og oppløsningsfremgangsmåter er blitt utviklet for kommersiell bruk. Med bruk av syntetisk biologi, det er et økt behov for et godt karakterisert plattform for å teste og uttrykke konstruert biologiske moduler og kretser. 18,19 Denne plattformen må væreallsidig, godt karakterisert, enkle å manipulere, og fokusert på bruker innkjøpte deler. Til tross utvikles et halvt århundre tidligere, cellefrie systemer basert på E. coli egen dele disse krav, da de er en forenklet in vitro fremstilling av cellulære prosesser uten at kompleksiteten i vekst og metabolisme. I tillegg har alle de grunnleggende kunnskap fra in vivo arbeide på E. coli gjelder lett til E. coli-celle-frie systemer. Selv om cellefrie ekspresjonssystemer kan ha programmer i syntetisk biologi, hittil målet for de fleste cellefritt uttrykk systemer har vært maksimering av protein og metabolitt yield. Dette oppnås ved hjelp av T7-bakteriofag transkripsjon av sekvenser drevet av T7 promotorer. 20. Selv om uttrykket er effektiv og robust, er disse systemer tjener et høyt spesialiserte formål. Cellereguleringsmetoder er begrenset, må mål-DNA-maler blireengineered å inkludere T7 arrangører, og enkelte sekvenser som ribosomal komplekser kan ikke bli transkribert og monteres. 21,22 Eksisterende cellefrie ekspresjonssystemer ikke klarer å opprettholde høy avkastning og samtidig bevare endogene reguleringsmekanismer, en nødvendig fleksibilitet for syntetisk biologi. Vi har utviklet en endogen E. coli cellefritt ekspresjonssystem som bevarer effektiviteten av protein ekspresjon demonstrert ved tidligere systemer, men tilføyer ytterligere fleksibilitet ved å tillate ekspresjon og regulering basert på både endogene og eksogene (T7 eller andre mekanismer). Protokollen er beskrevet her er opprinnelig basert på Kigawa et al. (2004) og Liu et al. (2005), men har betydelige modifikasjoner. Det benytter Mg-og K-glutamat enn Mg-og K-acetat for økt effektivitet, fjerner 2-mercaptoethanol, og lyserer celler ved hjelp av et kule-visp. 17,23,24 Bead-juling velges fremfor homogeniseringtrykk-baserte metoder, eller sonikering på grunn av sin lavere pris og sammenlignbare utbytter i konkurrerende systemer. 23. 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) benyttes som energikilde som det ble funnet å gi overlegne protein utbytter sammenlignet med kreatinfosfat og fosfoenolpyruvat. 4,25 Vårt system kan produsere opp til 0,75 mg / ml reporter protein ved hjelp av enten en sigma70-baserte arrangøren med lambda-fage operatører eller en T7-drevet promoter, lik avkastningen fra andre kommersielle systemer. 4,6 Fem dager er nødvendig for å produsere alle de nødvendige reagenser (figur 1). Videre gir det en 98% kostnadsreduksjon i forhold til sammenlignbare kommersielle cellefrie systemer - materielle kostnader er $ 0,11 per 10 mL reaksjon, som stiger til $ 0,26 med arbeid inkludert (figur 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Ideelle cellefrie ekspresjonssystemer kan teoretisk emulere en in vivo cellulær miljø på en kontrollert in vitro plattform. Ett Dette er nyttig for ekspresjon av proteiner og genetiske kretser på en kontrollert måte, så vel som for å tilveiebringe et miljø for proto syntetisk biologi. 2,3 For å oppnå det siste målet, celle-frie uttrykk systemer som bevarer endogen Escherichia coli transkripsjon-oversettelse mekanismer er i stand til mer nøyaktig gjenspeiler i vivo cellulære dynamikk enn de som er basert på T7 RNA polymerase transkripsjon. Vi beskriver utarbeidelse og gjennomføring av en effektiv endogen E. coli basert transkripsjon-transla-(TX-TL) cellefritt ekspresjonssystem som kan produsere ekvivalente mengder av protein som T7-baserte systemer med en 98% kostnadsreduksjon til lignende kommersielle systemer. 4,5 Fremstillingen av buffere og rå celleekstrakt er beskrevet, så vel som utførelse av entre rør TX-TL reaksjon. Hele protokollen tar fem dager for å forberede og gir tilstrekkelig materiale for opp til 3000 enkle reaksjoner i en forberedelse. Når forberedt, tar hver reaksjon etter 8 timers fra oppsett til datainnsamling og analyse. Mekanismer for regulering og transkripsjon eksogene til E. coli, slik som lac / Tet repressorer og T7 RNA-polymerase, kan kompletteres. seks Endogene egenskaper, slik som mRNA og DNA-nedbrytningshastigheter, kan også justeres. syv TX-TL cellefritt ekspresjonssystem er vist for stor skala kretsstevne, utforske biologiske fenomener, og uttrykket av proteiner under begge T7-og endogene arrangører. 6,8 Medfølgende matematiske modeller er tilgjengelig. 9,10 Den resulterende system har unike applikasjoner i syntetisk biologi som en prototyping miljø, eller &quot;TX- TL biomolekylære brødfjel. &quot;

Vi har presentert en fem dagers protokoll for fremstilling av en endogen Escherichia coli basert TX-TL cellefritt ekspresjonssystem. Et eksempel på tidslinjen for å lage de anvendte reagenser - urene celle-ekstrakt og buffer - kan finnes i figur 1. Når den er laget, kan disse lagres ved -80 ° C i opp til ett år. Etter reagenser er opprettet, kan eksperimentelle oppsett og gjennomføring gjøres på mindre enn åtte timer. I tillegg har vi optimalisert uttrykket betingelser TX-TL cellefritt ekspresjonssystem. Andre bruker levert tillegg, slik som buffere eller DNA-løsninger, bør kalibreres for toksisitet på forhånd. For eksempel, forskjellige metoder for behandling plasmider fører til ekspresjon forskjellig på grunn av saltinnholdet. Vi har også testet effekten av Tris-Cl elueringsbuffer på reaksjonseffektiviteten (Fig. 5). Et eksempel på rå celleekstrakt kalibrering, med henvisning trinn 4,1 til 4,9, er visti figur 4a. Generelt, våre forsøk viser at det urene celleekstrakt som er mest følsom for Mg-glutamat-nivåer, etterfulgt av K-glutamat-nivåer. For å demonstrere den cellefrie ekspresjonssystem, har vi konstruert og testet i en negativ tilbakekoblingssløyfe basert på tet undertrykkelse. 26 (figur 6). I det cellefrie ekspresjonssystem, samme krets løpe med og uten ATC viser et 7-fold end-point ekspresjon endring av deGFP reporter etter åtte timers uttrykk. Selv om dette eksperimentet ikke krever globale indusere eller repressors, om nødvendig de kan legges under &quot;Master Mix Forberedelse.&quot; <img alt="Figur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figur 1. Tidslinje for råolje celleekstrakt, aminosyreløsning, og energi-løsning preparat. Med en fem dagers timelin<html> e for en typisk gjennomføring av protokollen er gitt ovenfor, optimalisert for overnattings inkubasjoner og dagtid arbeidsmåten. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figur 2. Kostnader og uttrykk analyse av konkurrerende råolje celle ekstrakter. a) Fordeling av kostnader til arbeidskraft og materialer av TX-TL celle-ytringsfrihet system. Basert på kostnader av reagenser fra desember 2012, og lønnskostnader på $ 14 per time. B) Sammenligning av TX-TL cellefrie uttrykk systemkostnader kontra andre kommersielle systemer. Kostnadene fordeler seg per mL, selv om reaksjonsvolumer kan variere per kit. C) Sammenligning av TX-TL celle-fri ytring system avkastning vs andre kommersielle systemer. Protein uttrykk avkastning bestemmes av produsenten standarder./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større figur. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figur 3. Lasting og behandling av en perle-juling tube. a) demonstrasjon av riktig viskositet av celle-perle løsning. Cell-perle løsningen vil ha en viskositet avhengig av mange faktorer, blant annet hvor mye S30A buffer tilsatt, mengde perler lagt, og tid brukt på isen. B) Lasting av perle-juling røret før rask bordsentrifuge. Den sentrifuge fjerner bobler akkumulert under lasting. C) bobler til overflaten etter tabletop sentrifugering. Størrelsen på boblene vil variere, de kan være popped eller fjernes ved hjelp av en pipette tips d) Fullstendig fylt perle-juling røret før tildekking.. En menisk dannes i perle-slår tube, og hetten har nok til å dekke og forårsake små mengder til å overfylle. e) Korrekt lastet filter apparat. Disse kan gjenbrukes. F) Sammenligning av korrekt vs feilaktig behandlet perle-juling tube. Røret til venstre er et godt-beat tube - det har en liten og godt avgrenset øverste laget, og veldig klar supernatant. Røret til høyre er suboptimal, basert på den større, disig andre lag, og det uklare supernatanten. Rør som er suboptimal bør ikke gjennomgå ytterligere behandling. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figur 4. Egenskaper av råolje ekstrakt preparater. a) Typiske tomter kalibrerings for råolje celle ekstrakt. Rå ekstrakt er kalibrert for ytterligere Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT-nivåer, i den rekkefølgen. Vist er endepunkt fluorescence etter 8 timer, så vel som maksimal hastighet på proteinproduksjon basert på en 12-minutters glidende gjennomsnitt. Basert på disse tomter, er et akseptabelt utvalg av ekstra Mg-glutamat 4 mm, K-glutamat er 60-80 mM, og DTT er 0-3 mm. Merk at hver råekstrakt må kalibreres uavhengig for disse tre variablene. B) Variasjon fra ekstrakt forberedelser. Endpoint fluorescens av to Råekstrakter forberedt på forskjellige datoer vises; feilfelt er ett standardavvik fra tre uavhengige kjører på ulike dager. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figur 5. Effekter av DNA løsning på uttrykket effektivitet. a) Sammenligning av to forskjellige rensingmetoder for behandling av plasmider. 1 nM av pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 er utarbeidet ved hjelp av bare en QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification metode 1) eller post-behandlet med en QiaQuick PCR rensing kit (Purification metode 2). Vist er endepunkt fluorescens etter 8 timer, så vel som maksimal hastighet på proteinproduksjon basert på en 12-minutters glidende gjennomsnitt. Feilfelt er ett standardavvik fra fire uavhengige kjører på ulike dager. B) Effekt av elueringsbuffer (Tris-Cl). Forskjellige konsentrasjoner av Tris-Cl er sammenlignet i en cellefri ekspresjon reaksjon basert på ekspresjonen av 1 nM av pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Konsentrasjonene er gitt er endelige konsentrasjoner av Tris-Cl i reaksjonen; elueringsbufferen brukes er 10 mM Tris-Cl. Feilfelt er ett standardavvik fra tre uavhengige kjører på ulike dager. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figur 6. Prøve TX-TL kjøring av en negativ feedback-sløyfe. a) Prøve oppsett av en cellefri utførelse reaksjon. Tester &quot;på&quot; vs &quot;av&quot; state of the negative feedback loop, med positive og negative kontroller. B) plasmidkartet negativ feedback loop. C) Representative resultater. Data er basert på forsøk a) og b), med negative kontroll subtrahert fra signalet. Genetisk kretsen vist i innsatsen. Feilfelt er ett standardavvik fra tre uavhengige kjører på ulike dager. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Konsentrasjon </td><td> Beløp </td><td> Sterilisering </td><td> Merknader </td></tr><tr><td> Kloramfenikol (Cm) </td><td> 34 mg / ml i etanol </td><td> 1 ml </td><td> Filter sterilisere (0,22 mm) </td><td> Kan gjøres i større mengder som er lagret ved -20 ° C for senere bruk. </td></tr><tr><td> 2 x YT + P + Cm agar plate </td><td> 31 g / L 2 x YT, 40 mM kaliumhydrogenfosfat, 22 mM kaliumfosfat enbasisk, 34 mg / ml kloramfenikol </td><td> En plate </td><td> Autoklav </td><td></td></tr><tr><td> 2 x YT + P media </td><td> 31 g / L 2 x YT, 40 mM kaliumhydrogenfosfat, 22 mM kaliumfosfat enbasisk </td><td> 4 L </td><td> Autoklav </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Reagenser for dag 1 av Crude Cell Extract protokollen. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Konsentrasjon </strong&gt; </td><td> Beløp </td><td> Sterilisering </td><td> Merknader </td></tr><tr><td> Tris basen </td><td> 2. M </td><td> 250 ml </td><td> Filter sterilisere (0,22 mm) eller autoklav </td><td> Kan lagres ved romtemperatur. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> En M </td><td> 6 ml </td><td> Filter sterilisere (0,22 mm) </td><td> Kan lages i store volumer og lagret ved -20 ° C for senere bruk. </td></tr><tr><td> S30A buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7.7 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> For å nå pH 7,7, titrere med eddiksyre. Legg DTT 2 mM sluttkonsentrasjon like før bruk. Oppbevar ved 4 ° C. </td></tr><tr><td> S30B buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mm K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> For å nå pH 8,2, titrere med 2MTris. Legg DTT til 1 mM sluttkonsentrasjon like før bruk. Oppbevar ved 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Reagenser for dag to av Crude Cell Extract protokollen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falcon </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tomme 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon med pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellet masse (50 ml Falcon med pellet - tomt 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A buffer volum for å legge til (pellet masse * 0,9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Totale massen av perler å legge til (pellet masse * 5,0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. S30A buffer og perlemasse kalkulator, for dag tre av Crude Cell Extract protokollen. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Konsentrasjon </td><td> Beløp </td><td> Sterilisering </td><td> Merknader </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Ingen </td><td> For å nå pH 8, titrere med KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP og GTP, 94 mm CTP og UTP, pH 7,5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Ingen </td><td> For å nå pH 7,5, titrere med KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 mL </td><td> Ingen </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 mL </td><td> Ingen </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 mL </td><td> Ingen </td><td> For å nå pH 7,5-8, titrere med Tris på 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 mL </td><td> Ingen </td><td> For å nå pH 8, titrere med Tris på 2 M. </td></tr><tr><td> Folinsyre </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 mL </td><td> Ingen </td><td> Selv om bare 300 mL er nødvendig, er oppskriften på supplerende for 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> 1 M </td><td> 150 mL </td><td> Ingen </td><td> Lagres ved 4 ° C, varme til 37 ° C for å smelte. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Ingen </td><td> For å nå pH 7,5, titrere med Tris ved 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Reagenser for å forberede Energy Solution protokollen. Supplerende materiale ett. Oppskrifter for varer. Kloramfenikol, 34 mg / ml: Forbered 0,51 g kloramfenikol og legge etanol til 15 ml. Filter sterilisere (0,22 uM), prøve for å 1 ml rør, lagre ved -20 ° C for senere bruk. 2 x YT + P + Cm agarplate: Fremstill 1,24 g 2 x YT, 1,6 ml kaliumfosfat dibasisk løsning @ 1 M, 0,88 ml kaliumfosfat monobasisk-løsning @ 1 M, 0,6 g agar, og vann til 40 ml. Autoklav. Avkjøl til 50 ° C og tilsett 40 pl Cm. Delmengde 25 ml inn i en 100 x 15 mm petriskål, og la avkjøles i en time. 2 x YT + P medier: Forbered 124 g 2 x YT, 160 ml kaliumhydrogenfosfat løsning @ 1 M, 88 ml kalium fosfat enbasisk løsning @ 1 M, og vann til 4 L. Aliquot ut i 2 x 1,88 L og 0,24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Klar 60,57 g Tris base og vann til 250 ml. Steriliser, lagre på RT for senere bruk. DTT, 1 M: Fremstill 2,31 g DTT og vann til 15 ml. Filter sterilisere (0,22 uM), prøve for å 1 ml rør, lagre ved -20 ° C for senere bruk. S30A buffer: Fremstill 10,88 g Mg-glutamat og 24,39 g K-glutamat, 50 ml Tris med 2M, eddiksyre (til pH 7,7) og vann til 2 L. Autoklaver, oppbevar ved 4 ° C, tilsett 4 ml 1 M DTT før bruk. S30B buffer: Forbered 10.88 g Mg-glutamat og 24,39 g K-glutamat, Tris på 2 M (til pH 8,2), og vann til 2 L. Autoclave, oppbevar ved 4 ° C, tilsett 2 ml 1 M DTT før bruk. HEPES: Fremstill 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (til pH 8), og vann til 4 ml. tRNA: Fremstill 30 mg av tRNA og vann til 600 pl. CoA: Fremstill 30 mg CoA (MW 767,53), og vann til 600 pl. NAD: Legg 34.83 mg NAD (MW 663,43), Tris ved 2 M (pH 7,5-8), og vann til 300 pl. (Legg 27 pl av 2 M Tris ved å bringe løsningen til pH 7,5-8). cAMP: til 42,80 mg av cAMP (MW 329,22), Tris ved 2 M (til pH 8), og vann til 200 pl. (Legg 73 pl av 2 M Tris ved å bringe oppløsningens pH-verdi 8). Folinsyre (33,9 mm): Til 20 mg fast folinsyre kalsium salt (MW 511,5), tilsett 1,15 ml vann. Spermidin: Fremstill 23.55 pl av spermidin (MW 145,25), og vann til 150 pl. Forbered ved romtemperatur etter smelting kort på 37 ° C. 3-PGA: til 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris ved 2 M (pH 7,5), og vann til 3,2 ml. (Legg til 1,73 ml tris ved 2 M for å bringe løsningen til pH 7,5). Nucleotide Mix: Legg 145 mg av ATP kalium salt dihydrat (MW 619,4), 133 mg av GTP dinatrium salt (MW 567,14), 79,4 mg av CTP dinatriumsalt dihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumsalt dihydrat (MW 586,12) , KOH ved 15% fortynning (til pH 7,5) og vann til 1,5 ml. (Til 353 pl av KOH ved 15% fortynning for å bringe løsningen til pH 7,5). Supplerende materiale to. Bradford analysen. <ol><li> Fjern Bradford middel fra 4 ° C og satt ved romtemperatur. </li><li> Forbered 50 mL BSA standard ved 1 mg / ml og 0.1 mg / ml. </li><li> Forbered 40 mL 20x fortynning av ekstrakt fra trinn 1.47. </li><li> Legg 800 mL vann til 7 kyvetter. </li><li> Forbered standard kyvetter for 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 pl 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ul 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 pl 1 mg / ml BSA). </li><li> Forbered eksperimentelle kyvetter i 2 pl av prøven og 4 pl av prøven. </li><li> Legg 200 mL av Bradford agenten til hver kyvette og bland godt by pipettering. Inkuber ved romtemperatur i minst 10 min. </li><li> Produsere standard kurve på OD 595 nm med kyvetter fra trinn 6.5. Avvis standardkurve hvis r 2 &lt;0,95. </li><li> Bestem ekstrakt konsentrasjon på OD 595 nm med kyvetter fra trinn 6.6. </li></ol> Supplerende materiale tre. Buffer kalibrering regneark. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Se TXTL_e (mal) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Supplerende materiale fire. Cell-ytringsfrihet kjøre regneark. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Se TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Denne fem-dagers protokollen skisserer alle trinn, utstyr, og supplerende programvare som er nødvendig for å skape og drive en effektiv endogen Escherichia coli basert TX-TL celle-fri ytring system fra bunnen av. Med reagenser, tar protokollen 8 timer eller mindre å sette opp en reaksjon, samle inn og behandle data.

Protokoller for å gjennomføre en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basert TX-TL Cell-Free Expression System for syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartlegging Bakteriell Funksjonelle nettverk og veier i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Ved hjelp av syntetisk Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protokoll for Utarbeidelse av Electrocompetent<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Påvisning av Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mangefasetterte Fordeler med Protein Co-uttrykk i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Basert Cell ytringsfrihet Systemer for Expression of<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Rest-spesifikk innlemmelse av Noncanonical Amino Acids inn Modell Proteiner Bruke en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transkripsjon-oversettelse System