Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
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Agradecemos Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, e Enoque Yeung de assistência racionalização do protocolo, e Clare Chen e Barclay Lee para a assistência nos estágios iniciais do projeto. Este material é baseado no trabalho apoiado em parte pela Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA / MTO) programa Viver Fundições, número do contrato HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS é também apoiado por um cientista médico UCLA / Caltech Programa de Formação de comunhão e por um DoD, Força Aérea Escritório de Pesquisa Científica, Ciência de Defesa Nacional e de Pós-Graduação de Engenharia (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. As opiniões e conclusões contidas neste documento são de responsabilidade dos autores e não deve ser interpretada como representando oficialmente as políticas, de forma expressa ou implícita, da Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa ou do Governo dos EUA.

<ol>
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Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. 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NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. 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B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

TX-TL sistema de expressão livre de células baseado A Escherichia coli endógeno descrito aqui é uma reação fácil de executar três tubo que pode levar menos de oito horas de configurar a coleta de dados. O processo de criação de todos os reagentes exige cinco dias de tempo total (com exigências de trabalho significativas em apenas um dia), mas produz extrato bruto de 3.000 reações e buffer de tomada de reagentes para 10.000 reações (Figura 1). Além disso, o extrato bruto e buffer de tomada de reagentes são estáveis ​​por pelo menos 1 ano a -80 ° C, o que permite usos múltiplos de uma preparação. 4 Por US $ 0,11 por 10 reação mL (0,26 dólar incluindo trabalho), os custos são 98% menores do que comparáveis sistemas comerciais (Figura 2). Há algumas limitações não resolvidos, no entanto, para o sistema. A eficiência final de cada preparação de extracto celular bruto pode variar de acordo com a proficiência utilizador e das condições ambientais, apesar de tTípica variação de rendimento situa-se entre 5-10% (Figura 4b). Como um resultado disso, a variabilidade de lote para lote, em ambos expressão de ponto final e na dinâmica de expressão devem ser esperados. Essas variações provavelmente permanecerá até que o extrato é totalmente caracterizado ou até a criação de extrato é totalmente automatizado. Se o sistema de expressão isento de células é utilizado para conduzir as experiências quantitativas sensíveis, é aconselhável para executar todas as experiências com o mesmo lote de extracto celular bruto. O rendimento a partir de um único lote extracto celular em bruto, de cerca de 3000 reacções, deve ser suficiente para cursos experimentais típicos. Embora nós suspeitamos variação pode ser removido por ampliação e automatizar o procedimento, tais tentativas envolveria um investimento substancial de recursos. Além disso, embora os níveis de expressão de ponto final são razoavelmente fácil de determinar, mais trabalho precisa ser feito de compreensão dinâmica intrínseca ao sistema livre de células. Sabe-se que tanto competitio recurson e limitação de recursos pode afetar a dinâmica de expressão. Por exemplo, Sigma endógena limitada 70 pode resultar em um regime de saturação com o aumento da produção de um molde de ADN de perfil de expressão análogo ao de depleção de nucleótidos ou de aminoácidos. 9,27 Contudo, dinâmica não tem que ser totalmente entendido a utilizar o sistema. Para aumentos puros de produtividade, otimização pode ser feito por métodos de aprendizado de máquina. 28 questões de concorrência de recursos e limitação pode ser dirigida por modelos matemáticos verificado utilizando dados experimentais. O protocolo aqui apresentado é otimizado para uma cepa BL21-Rosetta2, mas é generalizável a outros E. coli. Modificações em BL21-Rosetta2, tais como a remoção do gene que codifica a protease lon e a adição de genes que codificam para tRNAs raros, para permitir que a produção de proteína máxima. Tentamos o protocolo com duas outras cepas de extrato - BL21 só e uma BL21 trxA nocaute-and encontrou 50% menos produção de proteína. Nossa hipótese é que os rendimentos da mesma forma diminuir quando se utiliza outras cepas. Outras mudanças nos parâmetros, como alternar meio de crescimento 2xYT para LB e outros caldos ricos, resultaram em produção de proteína diminuiu. Sistemas de expressão livre de celulares que utilizam tanto endógenos e exógenos maquinaria de transcrição-tradução e mecanismos de regulação têm larga aplicação em proteínas e expressão de metabólitos e da biologia sintética. 3,29 Em vez de se limitar aos circuitos regulados-T7, pode-se imaginar a produzir biomoléculas complexas em um ambiente controlável pelo usuário usando uma mistura de E. nativa promotores de E. coli e os mecanismos de transcrição e regulação exogenamente fornecidos. Sem limitações de divisão celular e o metabolismo, a variabilidade em circuitos sintéticos, tais como o repressilator ou em vias metabólicas de engenharia, tais como aqueles que produzem artemisinina pode ser reduzida ou melhor compreendida. 30,31 Nós have usado essas vantagens para implementar interruptores genéticos, bem como para entender sigma fator seqüestro 9,32 Essa tecnologia também pode formar a espinha dorsal do &quot;mínimo&quot; ou células &quot;artificiais&quot; -. pequeno, bem caracterizados e unidades encarnados auto-suficientes de extrato. 33,34 Em última análise, nós antecipamos usos imediatos deste sistema de expressão livre de células endógenas como um ambiente de prototipagem para a biologia sintética. Apelidado de &quot;TX-TL biomolecular placa de ensaio&quot;, o sistema de expressão isento de células fornece um ambiente controlado, onde circuitos sintéticos destinasse para a expressão in vivo pode ser submetido a ciclos de prototipagem - ciclos de ensaio com o plasmídeo básico, linear, ou ADN sintetizado quimicamente, seguido por análise e modificação rápida. Rounds prototipagem pode ser auxiliada por modelos matemáticos preditivos sendo desenvolvidos atualmente. Ao remover a clonagem e manipulação vivo para circuitos não-finais, prevemos engenhariatempos de ciclo nharia de ser reduzida para 1-3 dias em vez de padrão das correntes semanas.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Expressão tecnologia sem celular começou na década de 1950 como puramente translacional, avançando anos mais tarde para incluir mecanismos de transcrição-tradução juntamente com DNA bacteriófago T7. 11,12 Desde então, foram feitos inúmeros esforços para otimizar a criação de extrato celular bruto (ou E extrato. coli S30). 13,14 Essas otimizações incluem prolongar a síntese de proteína livre de células através da regeneração de ATP ou modificações de tensão e reduzindo o tempo de protocolo e custo. existem 15-17 sistemas alternativos de expressão livre de celulares que usam reconstituído componentes em vez de bruto extracto de células para a expressão. 5 Ambos extracto celular bruto e métodos de reconstituição foram desenvolvidos para uso comercial. Com o advento da biologia sintética, existe um aumento da necessidade para uma plataforma bem caracterizado para testar e expressar módulos e circuitos biológicas modificadas. 18,19 Esta plataforma tem de serversátil, bem caracterizada, simples de manipular, e focada em componentes fornecidos pelo usuário. Apesar de ter sido desenvolvido meio século antes, os sistemas livres de células baseado em E. coli intrinsecamente compartilhar esses requisitos, pois eles são uma representação simplificada em vitro de processos celulares, sem a complexidade de crescimento e metabolismo. Além disso, todo o conhecimento fundamental de trabalho em vivo em E. coli aplica prontamente para E. sistemas livres de células de E. coli. Embora os sistemas de expressão livre de células pode ter aplicações em biologia sintética, até à data o objetivo da maioria dos sistemas de expressão livre de células tem sido a maximização de proteína e rendimento de metabólito. Isto é conseguido através da utilização do bacteriófago T7 de transcrição de sequências conduzidos pelos promotores de T7. 20 Embora a expressão eficiente e robusta, estes sistemas servem um propósito altamente especializado. Métodos de regulação celular são limitadas, modelos de DNA-alvo deve serredesenhado para incluir promotores T7, e certas sequências, como complexos ribossomais não pode ser transcrito e montado. 21,22 existentes sistemas de expressão livre de células são incapazes de manter altos rendimentos preservando mecanismos reguladores endógenos, a versatilidade necessária para a biologia sintética. Nós desenvolvemos uma E. endógeno sistema de expressão de E. coli isento de células que mantém a eficiência da expressão proteica demonstrado pelos sistemas anteriores, mas adiciona versatilidade adicional, permitindo a expressão e regulação baseada em ambos (T7 ou outros mecanismos) endógeno e exógeno. O protocolo aqui descrito é baseado no Kigawa et al. (2004) e Liu et al. (2005), mas não tem modificações significativas. Ele utiliza-Mg e K-glutamato sobre Mg e K-acetato para o aumento da eficiência, remove 2-mercaptoetanol, e lisa células usando um talão-batedor. 17,23,24 Bead-surra é escolhido em detrimento de homogeneização,métodos baseados em pressão, ou de ultra-sons, devido ao seu menor custo e rendimentos comparáveis ​​aos sistemas concorrentes. 23 ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) é utilizado como fonte de energia, uma vez que foi encontrada para dar rendimentos de proteína de qualidade superior quando comparada com o fosfato de creatina e fosfoenolpiruvato. 4,25 nosso sistema pode produzir-se de 0,75 mg / ml de proteína repórter usando um promotor à base de sigma70 com operadores lambda-fago ou um promotor de T7-driven, semelhante aos rendimentos de outros sistemas comerciais. 4,6 Cinco dias são necessárias para produzir todos os reagentes necessários (Figura 1). Além disso, proporciona uma redução de custos de 98% em comparação com os sistemas livres de células comerciais comparáveis ​​- os custos de material são de US $ 0,11 por 10 mL de reação, que aumenta para $ 0,26 com mão de obra incluída (Figura 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Sistemas ideais de expressão isentos de células, pode, teoricamente, emular um ambiente celular in vivo de uma forma controlada em plataforma vitro. Uma Isto é útil para a expressão de proteínas e circuitos genéticos de uma forma controlada, bem como para proporcionar um ambiente de prototipagem por biologia sintética. 2,3 Para alcançar o segundo objetivo, sistemas de expressão livre de células que preservam endógeno Escherichia coli mecanismos de transcrição-tradução é capaz de refletir com mais precisão in vivo dinâmica celular do que aqueles baseados em T7 RNA polimerase de transcrição. Nós descrevemos a preparação e execução de um E. endógena eficiente 4,5 base coli transcrição-tradução (TX-TL) livre de células sistema de expressão que pode produzir quantidades equivalentes de proteína como sistemas baseados em T7 em uma redução de custos de 98% para os sistemas comerciais similares. A preparação de tampões e extrato celular bruto são descrito, bem como a realização de umtrês tubo de reacção TX-TL. O protocolo inteiro leva cinco dias para preparar e rende material suficiente para até 3000 reações individuais em uma preparação. Depois de preparado, cada reação leva menos de 8 horas de configuração para a coleta de dados e análise. Mecanismos de regulação e transcrição exógeno ao E. coli, tais como repressores lac / tet e T7 ARN polimerase, pode ser completada. 6 propriedades endógenas, tais como ARNm e as taxas de degradação de ADN, pode também ser ajustado. 7 O sistema de expressão isento de células TX-TL tem sido demonstrado para os grandes montagem escala circuito, explorando fenômenos biológicos, e expressão de proteínas em ambos os promotores T7 e endógenos. 6,8 modelos matemáticos de acompanhamento estão disponíveis. 9,10 O sistema resultante tem aplicações exclusivas em biologia sintética como um ambiente de prototipagem, ou &quot;TX- placa de ensaio TL biomolecular &quot;.

Nós apresentamos um protocolo de cinco dias para a preparação de uma Escherichia coli endógeno com base TX-TL sistema de expressão isento de células. A linha do tempo da amostra para a criação de reagentes - extracto celular bruto e tampão - pode ser encontrada na Figura 1. Uma vez criado, estes podem ser armazenados a -80 ° C durante até um ano. Depois de reagentes são criados, configuração e execução experimental pode ser feito em menos de 8 horas. Além disso, optimizado as condições do sistema de expressão isento de células TX-TL de expressão. Outras adições fornecidos pelo usuário, tais como tampões ou soluções de DNA, deve ser calibrado para a toxicidade de antemão. Por exemplo, os diferentes métodos de transformação plasmídeos resultar na expressão diferente devido ao teor de sal. Também testámos o efeito de tampão de eluição de Tris-Cl a eficiência da reacção (Figura 5). Um exemplo de calibração extracto celular em bruto, referindo passo 4,1-4,9, é mostradona figura 4a. Em geral, as nossas experiências demonstram que o extracto celular bruto é mais sensível aos níveis de Mg-glutamato, seguida por níveis K-glutamato. Para demonstrar o sistema de expressão isento de células, construiu-se e testou um circuito de retroalimentação negativa com base na repressão tet. 26 (Figura 6). No sistema de expressão livre de células, o mesmo circuito prazo com e sem aTc mostra uma de 7 vezes de ponto final a mudança de expressão deGFP repórter após oito horas de expressão. Embora nesta experiência não requer indutores globais ou repressores, se necessário, eles podem ser adicionados em &quot;Master Mix Preparação.&quot; <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figura 1. Cronograma para extrato celular bruto, solução de aminoácidos, e preparação da solução de energia. Uma timelin cinco dias<html> e para uma execução típica do protocolo é dado acima, otimizado para incubações durante a noite e as etapas de trabalho durante o dia. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figura 2. Custo e análise de extratos de células bruto competindo expressão. a) Composição dos custos de mão de obra e materiais do sistema de expressão livre de células TX-TL. Com base nos custos de reagentes a partir de dezembro de 2012, e os custos trabalhistas de US $ 14 por hora. B) Comparação de TX-TL livres de células custos do sistema de expressão versus outros sistemas comerciais. Os custos são divididos por mL, apesar de volumes de reação pode variar por kit. C) Comparação de TX-TL livre de células rendimento sistema de expressão versus outros sistemas comerciais. Expressão da proteína rendimento determinado por normas fabricante./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figura 3. Carregando e processamento de um tubo de talão-de bater. a) Demonstração da correta viscosidade da solução de células-pérola. Solução Cell-talão terá uma viscosidade depende de muitos fatores, incluindo a quantidade de tampão S30A adicionado, a quantidade de contas adicionadas, e passou um tempo no gelo. B) Carregamento de tubo batendo talão antes rápida centrifugação mesa. A centrifugação remove bolhas acumuladas durante o carregamento. C) Bolhas tona após tabletop centrifugação. O tamanho das bolhas irá variar, pois eles podem ser estalado ou removida utilizando uma ponta de pipeta d) do tubo-batendo grânulo completamente preenchido antes de nivelamento.. Um menisco é formado na batendo talão tube, ea tampa tem o suficiente para cobrir e causar pequenas quantidades para transbordar. e) aparelho de filtro corretamente carregado. Estes podem ser reutilizados. F) Comparação das correctamente vs tubo batendo cordão processado de forma incorrecta. O tubo da esquerda é um tubo bem-beat - apresenta um pequeno e bem delineado camada superior, e sobrenadante muito claro. O tubo da direita é sub-óptima, com base na maior, a segunda camada turva e nebulosa o sobrenadante. Tubos que são de qualidade inferior não devem ser submetidos a processamento adicional. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figura 4. Propriedades de preparações de extrato bruto. a) parcelas de calibração típicas para extrato celular bruto. O extrato bruto é calibrado para o Mg-glutamato adicional, K-glutamato, e os níveis de DTT, nessa ordem. É mostrado endpoint fluorescence depois de 8 horas, bem como a taxa máxima de produção de proteínas com base em uma média móvel de 12 minutos. Com base nestes lotes, um intervalo aceitável de Mg-glutamato adicional é de 4 mM, K-glutamato é de 60-80 mM, e DTT é 0-3 mM. Note-se que cada extrato bruto precisa ser calibrado de forma independente para estas três variáveis. B) Variação de preparações de extrato. Endpoint fluorescência de dois extratos preparados em datas diferentes é mostrada; barras de erro são um desvio padrão de três corridas independentes em dias diferentes. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figura 5. Efeitos da solução de DNA sobre a eficiência de expressão. a) Comparação de dois purificação diferentemétodos para a transformação de plasmídeos. 1 nM de pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 é preparado utilizando apenas um Kit Qiaprep rotação Miniprep (método de purificação 1) ou pós-processado com um kit de purificação Qiaquick PCR (método de purificação 2). É mostrado o ponto final de fluorescência após 8 horas, bem como a taxa máxima de produção de proteínas com base em uma média móvel de 12 minutos. As barras de erro são um desvio padrão de quatro ensaios independentes em dias diferentes. B) Efeito de tampão de eluição (Tris-Cl). Diferentes concentrações de Tris-Cl são comparados numa reacção de expressão isento de células com base na expressão de 1 nM de pBEST-OR2 OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. As concentrações dadas são as concentrações finais de Tris-Cl na reacção; tampão de eluição utilizado é 10 mM Tris-Cl. As barras de erro são um desvio padrão de três corridas independentes em dias diferentes. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <p class="jove_content" fo:manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figura 6. Amostra TX-TL de execução de um ciclo de feedback negativo. a) configuração Amostra de uma reação execução livre de células. Testes &quot;na&quot; versus &quot;off&quot; estado de loop de feedback negativo, com controles positivos e negativos. B) plasmídeo mapa de ciclo de feedback negativo. C) Os resultados representativos. Dados reflecte experimento em a) e b), com controlo negativo subtraído do sinal. Circuito genético mostrado na inserção. As barras de erro são um desvio padrão de três corridas independentes em dias diferentes. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Concentração </td><td> Quantidade </td><td> Esterilização </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Cloranfenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml em etanol </td><td> 1 ml </td><td> Filtro de esterilizar (0,22 mM) </td><td> Pode ser feito em grandes volumes armazenados a -20 ° C para uso posterior. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + placa Cm agar </td><td> 31 g / L de 2 x YT, 40 mM de fosfato dibásico de potássio, 22 mM de fosfato de potássio, 34 ug / ml de cloranfenicol </td><td> 1 placa </td><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P mídia </td><td> 31 g / L de 2 x YT, 40 mM de fosfato dibásico de potássio, 22 mM de fosfato de potássio monobásico </td><td> 4 G </td><td> Autoclave </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes para dia 1 de protocolo extrato celular bruto. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Concentração </strong&gt; </td><td> Quantidade </td><td> Esterilização </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filtro de esterilizar (0,22 mM) ou autoclave </td><td> Pode ser armazenada à temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filtro de esterilizar (0,22 mM) </td><td> Pode ser feito em grandes volumes e armazenado a -20 ° C para uso posterior. </td></tr><tr><td> Tampão S30A </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para atingir pH 7,7, titula-se com ácido acético. Adicionar DTT 2 mM concentração final imediatamente antes da utilização. Armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Tampão S30B </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, ~ 5 mM de Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para atingir pH 8,2, titular com 2MTris. Adicionar DTT a 1 mM concentração final imediatamente antes da utilização. Armazenar a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes para o dia 2 de protocolo extrato celular bruto. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falcão </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vazio de 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon com pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Massa Pellet (50 ml Falcon com pellet - vazio 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volume de tampão S30A adicionar (massa sedimento * 0.9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Massa total de contas para adicionar (massa pellet * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Tampão S30A e calculadora massa talão, para o dia 3 de protocolo extrato celular bruto. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Concentração </td><td> Quantidade </td><td> Esterilização </td><td> Notas </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Nenhum </td><td> Para chegar a pH 8, titular com KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> ATP e GTP 156 mM, CTP e UTP, 7,5 mM de pH 94 </td><td> 1,5 ml </td><td> Nenhum </td><td> Para atingir pH 7,5, titular com KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 mL </td><td> Nenhum </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 mL </td><td> Nenhum </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 ul </td><td> Nenhum </td><td> Para atingir pH 7,5-8, titular com Tris a 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 ul </td><td> Nenhum </td><td> Para chegar a pH 8, titular com Tris a 2 M. </td></tr><tr><td> O ácido folínico </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 ul </td><td> Nenhum </td><td> Apesar de serem necessárias apenas 300 mL, em receita suplementar é de 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Espermidina </td><td> 1 M </td><td> 150 ul </td><td> Nenhum </td><td> Armazenar a 4 ° C, aquecer a 37 ° C para derreter. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Nenhum </td><td> Para atingir pH 7,5, titular com Tris a 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Reagentes para se preparar para o protocolo Energy Solution. Material suplementar 1. Receitas para itens. O cloranfenicol, 34 mg / ml: Preparar 0,51 g cloranfenicol e adicionar etanol a 15 ml. Filtro de esterilizar (0,22 mM), alíquota de 1 ml tubos, armazenar a -20 ° C para uso posterior. 2xYT + P + Cm placa de ágar: Preparar 1,24 g 2xYT, solução dibásico 1,6 ml de fosfato de potássio @ 1 M, 0,88 ml de solução de fosfato de potássio @ 1 M, 0,6 g de agar e água a 40 ml. Autoclave. Deixar arrefecer para 50 ° C e adicionar 40 ul Cm. Alíquota de 25 ml em uma placa de Petri de 100 x 15 mm, e deixe esfriar por uma hora. 2xYT + P media: Preparar 124 g de 2 x YT, solução dibásica de fosfato de 160 ml de potássio @ 1 M, solução de 88 ml de fosfato de potássio monobásico @ 1 M e de água a 4 L. Aliquot fora em 2 x 1,88 L e 0,24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60,57 g de base Tris e água para 250 ml. Esterilizar, armazenar à temperatura ambiente para uso posterior. DTT, 1 M: Preparar 2,31 g DTT e água para 15 ml. Filtro de esterilizar (0,22 mM), alíquota de 1 ml tubos, armazenar a -20 ° C para uso posterior. Tampão S30A: Preparar 10,88 g de Mg-glutamato e 24,39 g de K-glutamato, 50 ml de Tris a 2 M, ácido acético (para pH 7,7), e água a 2 L. Autoclave, armazenar a 4 ° C, adicionar 4 ml de 1 M DTT antes do uso. Tampão S30B: Preparar 10,88 g de Mg-glutamato e 24,39 g de K-glutamato, Tris a 2 M (a pH 8,2), e água a 2 L. Autoclave, armazenar a 4 ° C, adicionar 2 ml de DTT 1 M antes da utilização. HEPES: Preparar 1,91 g de HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), e água até 4 ml. ARNt: Preparar 30 mg de tRNA e água para 600 ul. CoA: Preparar 30 mg de CoA (MW 767,53) e água para 600 ul. NAD: Adicionar 34,83 ​​mg de NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), e água para 300 ml. (Adicionar 27 ul de Tris a 2 M para trazer a solução para pH 7,5-8). AMPc: Adicionar 42,80 mg de AMPc (MW 329,22), Tris a 2 M (a pH 8), e água para 200 ul. (Adicionar 73 ul de Tris a 2 M para trazer a solução para pH 8). Ácido folinico (33,9 mM): 20 mg de sal de cálcio de ácido folínico sólido (PM 511,5), adicionar 1,15 ml de água. Espermidina: Prepare 23,55 mL de espermidina (MW 145,25) e água para 150 mL. Prepare à temperatura ambiente após a fusão brevemente a 37 ° C. 3-PGA: Adicionar 1,03 g de 3-PGA (MW 230.02), Tris a 2 M (a pH 7,5), e água a 3,2 ml. (Adicionar 1,73 ml de Tris a 2 M para levar a solução a pH 7,5). Nucleotide Mix: Adicionar 145 mg de ATP dipotássico dihidratado sal (MW 619,4), 133 mg de GTP sal dissódico (MW 567,14), 79,4 mg de sal dissódico di-hidratado CTP (MW 563,16), 82,6 mg de sal trissódico dihidratado UTP (MW 586,12) , KOH a uma diluição de 15% (até pH 7,5), e água a 1,5 ml. (Adicionar 353 mL de KOH a 15% de diluição para levar a solução a pH 7,5). Material suplementar 2. Ensaio de Bradford. <ol><li> Retirar agente Bradford de 4 ° C e ajustado para a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 50 ul de BSA padrão a 1 mg / ml e de 0,1 mg / ml. </li><li> Prepare 40 mL de 20x de diluição do extrato do passo 1.47. </li><li> Adicionar 800 mL de água para 7 tinas. </li><li> Prepare cuvetes padrão para 0 mg / mL, 1 mg / ml (10 ul de 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul de 0,1 mg / ml de BSA), 4 mg / ml (4 ul de 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ul de 1 mg / ml BSA). </li><li> Prepare cuvetes experimentais para 2 mL de amostra e 4 ul de amostra. </li><li> Adicionar 200 ul de agente de Bradford a cada cuvete e misturar bem by pipetagem. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. </li><li> Produção da curva padrão em OD 595 nm, utilizando cuvetes do passo 6.5. Rejeitar curva padrão, se r 2 &lt;0,95. </li><li> Determinar a concentração de extrato de OD 595 nm usando tinas do passo 6.6. </li></ol> Material suplementar 3. Tampão planilha de calibração. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Veja TXTL_e (modelo) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Material suplementar 4. Expressão livre-Cell executar planilha. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Veja TXTL _JoVE.xlsx</a> .

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Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

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