Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
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Agradecemos Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, y Enoc Yeung asistencia racionalización del protocolo, y Clare Chen y Lee Barclay para la ayuda en las primeras etapas del proyecto. Este material está basado en trabajo apoyado en parte por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA / MTO) Programa Living Fundiciones, número de contrato HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS está también apoyado por un Científico Médico UCLA / Caltech Programa de becas de formación y de un Departamento de Defensa, la Fuerza Aérea Oficina de Investigación Científica, Defensa Nacional de Ciencia e Ingeniería de Posgrado (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no debe interpretarse como la representación de oficialmente las políticas, ya sea expresa o implícita, de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa o el Gobierno de los EE.UU..

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Sistema de expresión libre de células TX-TL basado La Escherichia coli endógeno descrito aquí es una reacción simple-to-run de tres tubos que pueden tener menos de ocho horas de creado para la recopilación de datos. El proceso de creación de todos los reactivos requiere un total de cinco días de tiempo (con requisitos laborales importantes en un solo día), pero produce extracto crudo de 3.000 reacciones y el tampón de decisiones reactivos para 10.000 reacciones (Figura 1). Por otra parte, el extracto crudo y amortiguan de decisiones reactivos son estables durante al menos 1 año a -80 ° C, lo que permite múltiples usos de una preparación de 4. A $ 0,11 por 10 l de reacción (0,26 dólares incluyendo mano de obra), los costos son 98% más bajo que comparables sistemas comerciales (Figura 2). Hay algunas limitaciones sin resolver, sin embargo, para el sistema. La eficiencia final de cada preparación de extracto celular crudo puede variar en función de la aptitud del usuario y de las condiciones ambientales, aunque tla variación del rendimiento RUEBAS es entre 5-10% (Figura 4b). Como resultado, la variabilidad de lote a lote en tanto la expresión de punto final y en la dinámica de la expresión son de esperar. Estas variaciones probablemente se mantendrá hasta que el extracto está completamente caracterizado, o hasta que la creación de extracto está totalmente automatizado. Si el sistema de expresión libre de células se utiliza para llevar a cabo experimentos cuantitativos sensibles, es aconsejable ejecutar todos los experimentos con el mismo lote de extracto celular crudo. El rendimiento de un solo lote extracto celular crudo, unos 3.000 reacciones, debe ser suficiente para los cursos típicas experimentales. Aunque sospechamos variación puede ser removido por la ampliación y la automatización del procedimiento, tales intentos implicarían una inversión sustancial de recursos. Además, si bien los niveles de punto final de expresión son razonablemente fáciles de determinar, aún queda trabajo por hacer en la dinámica de la comprensión intrínsecas al sistema libre de células. Se sabe que tanto COMPETENCIA recursosn de recursos y limitación puede afectar la dinámica de expresión. Por ejemplo, limitada Sigma endógeno 70 puede dar lugar a un régimen de saturar con el aumento de la plantilla de ADN que produce un perfil de expresión análoga a la de nucleótidos o aminoácidos agotamiento. 9,27 Sin embargo, la dinámica no tienen que ser entendidos completamente para utilizar el sistema. Para los aumentos puros de rendimiento, optimización se puede hacer mediante métodos de aprendizaje automático. 28 Cuestiones de competencia por los recursos y la limitación pueden ser abordadas por los modelos matemáticos verificó utilizando datos experimentales. El protocolo que se presenta aquí está optimizado para una cepa BL21-Rosetta2, pero es generalizable a otras E. cepas de E. coli. Modificaciones en BL21-Rosetta2, tales como la eliminación del gen que codifica la proteasa lon y la adición de genes que codifican los ARNt raros, permiten para la producción máxima de proteínas. Hemos tratado el protocolo con otras dos cepas de extracto - sólo BL21 y un golpe de gracia-una BL21 trxAd encontraron 50% menos de producción de proteína. Nuestra hipótesis es que los rendimientos disminuyen de manera similar cuando se utilizan otras cepas. Otros cambios en los parámetros, tales como la conmutación de medio de crecimiento 2xYT para LB y otros caldos ricos, han dado lugar a la producción de proteína disminuido. Sistemas de expresión sin células utilizando tanto la maquinaria de transcripción-traducción endógeno y exógeno y los mecanismos de regulación tienen amplias aplicaciones en proteínas y expresión metabolito y de la biología sintética. 3,29 En vez de estar limitado a los circuitos T7-regulada, se puede imaginar la producción de biomoléculas complejas en un entorno controlable por el usuario usando una mezcla de E. nativa promotores coli y mecanismos de transcripción y regulación suministrados exógenamente. Sin limitaciones de la división celular y el metabolismo, la variabilidad en los circuitos sintéticos tales como el Represilador o en las vías metabólicas de ingeniería tales como los que producen artemisinina se puede reducir o mejor entendida. 30,31 Have utilizado estas ventajas para implementar interruptores genéticos, así como para entender sigma factor de secuestro de 9,32 Dicha tecnología también puede formar la columna vertebral de la &quot;mínima&quot; o células &quot;artificiales&quot; -. pequeño, bien caracterizado y unidades encarnados autosuficientes de extracto de 33,34. En última instancia, esperamos usos inmediatos de este sistema de expresión libre de células endógenas como un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. Apodado el &quot;TX-TL breadboard biomolecular&quot;, el sistema de expresión libre de células proporciona un entorno controlable donde los circuitos sintéticos cuyo destino final es la expresión in vivo pueden someterse a rondas de prototipos - ciclos de pruebas en el plásmido básico, lineal, o ADN sintetizado químicamente, seguido por el análisis y la modificación rápida. Rondas prototipos pueden ser ayudados por los modelos matemáticos predictivos que se están desarrollando actualmente. Mediante la eliminación de la clonación y la manipulación en vivo para circuitos no finales, anticipamos ingenieríatiempos de ciclo niería para ser reducidos a 1-3 días en lugar de los estándar actuales semana.

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Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Tecnología de expresión libre de células se inició en la década de 1950 como puramente traslacional, avanzando año más tarde para incluir mecanismos de transcripción-traducción acopladas utilizando el ADN del bacteriófago T7. 11,12 Desde entonces, se han realizado numerosos esfuerzos para optimizar la creación de extracto celular crudo (o E . extracto coli S30). 13,14 Estas optimizaciones incluyen la prolongación de la síntesis de proteínas libre de células a través de la regeneración de ATP o modificaciones de tensión y reduciendo el tiempo de protocolo y el costo. existen 15-17 sistemas de expresión de células libres alternativos que uso reconstituido componentes en lugar de crudo extracto de células para la expresión. 5 Tanto extracto celular crudo y métodos de reconstitución se han desarrollado para uso comercial. Con el advenimiento de la biología sintética, existe una mayor necesidad de una plataforma bien caracterizado para probar y expresar módulos y circuitos biológicos de ingeniería. 18,19 Esta plataforma debe serversátil, bien caracterizado, fácil de manipular, y se centró en los componentes suministrados por el usuario. A pesar de haber desarrollado la mitad de un siglo antes, los sistemas libres de células basadas en E. coli intrínsecamente compartir estos requisitos, ya que son una representación simplificada en vitro de procesos celulares sin la complejidad de crecimiento y el metabolismo. Además, todos los conocimientos básicos de trabajo en vivo en E. coli se aplica fácilmente a E. sistemas libres de células de E. coli. Aunque los sistemas de expresión de células libres pueden tener aplicaciones en la biología sintética, hasta la fecha el objetivo de la mayoría de los sistemas de expresión de células libres ha sido la maximización de la proteína y la producción de metabolitos. Esto se logra mediante el uso de bacteriófago T7 transcripción de secuencias conducidos por promotores T7. 20 Aunque la expresión es eficiente y robusta, estos sistemas sirven a un propósito altamente especializado. Métodos de regulación de la célula son limitados, las plantillas de ADN de destino deben serrediseñados para incluir promotores T7, y ciertas secuencias tales como complejos ribosómicos no se pueden transcribir y ensamblados. 21,22 sistemas de expresión libres de células existentes son incapaces de mantener altos rendimientos preservando al mismo tiempo los mecanismos de regulación endógenos, una versatilidad necesaria para la biología sintética. Hemos desarrollado una E. endógena sistema de expresión libre de células coli que conserva la eficiencia de la expresión de la proteína demostrado por los sistemas anteriores pero añade versatilidad adicional al permitir la expresión y la regulación sobre la base de ambos mecanismos (T7 u otros) endógeno y exógeno. El protocolo descrito aquí está basada originalmente en Kigawa et al. (2004) y Liu et al. (2005), pero tiene importantes modificaciones. Se utiliza Mg y K-glutamato sobre Mg-y K-acetato de etilo para aumentar la eficiencia, quita 2-mercaptoetanol, y la lisis de las células usando un cordón-batidor. 17,23,24 bolas-latidos se elige sobre la homogeneización,métodos basados ​​en la presión, o sonicación debido a su menor coste y rendimientos comparables a los sistemas de la competencia. 23 ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) se utiliza como la fuente de energía ya que se encontró para dar rendimientos de proteínas superiores en comparación con el fosfato de creatina y fosfoenolpiruvato. 4,25 Nuestro sistema puede producir hasta 0,75 mg / ml de proteína indicadora utilizando un promotor con sede en sigma70 con los operadores-fago lambda o un promotor T7 impulsado, de forma similar a los rendimientos procedentes de otros sistemas comerciales. 4,6 Cinco días son necesarias para producir todos los reactivos necesarios (Figura 1). Además, proporciona una reducción de costes del 98% en comparación con los sistemas comparables de células libres de comerciales - costes de material son de $ 0.11 por 10 l de reacción, que se eleva a 0,26 dólares, con mano de obra incluida (Figura 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Sistemas de expresión de ideales sin células pueden emular teóricamente un entorno celular in vivo en un control en la plataforma vitro. 1 Esto es útil para expresar las proteínas y los circuitos genéticos de una manera controlada, así como para proporcionar un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. 2,3 Para lograr este último objetivo, los sistemas de expresión de células libres que preservan mecanismos de transcripción-traducción Escherichia coli endógenas son capaces de reflejar con mayor precisión la dinámica celular in vivo que los basados ​​en T7 RNA polimerasa de transcripción. Se describe la preparación y ejecución de un desarrollo endógeno E. eficiente la transcripción-traducción basada coli (TX-TL) sistema de expresión libre de células que pueden producir cantidades equivalentes de proteína como los sistemas basados ​​en T7 en una reducción de costes del 98% a los sistemas comerciales similares. 4,5 La preparación de tampones y extracto celular en bruto se descrito, así como la ejecución de untres tubos de reacción TX-TL. El protocolo completo dura cinco días para preparar y produce material suficiente para un máximo de 3.000 reacciones individuales en una preparación. Una vez preparado, cada reacción tiene menos de 8 horas desde la configuración hasta la recolección y análisis de datos. Mecanismos de regulación de la transcripción y exógena a la E. coli, tales como represores lac / tet y ARN polimerasa de T7, se puede complementar. 6 propiedades endógenos, tales como ARNm y las tasas de degradación de ADN, también se puede ajustar. 7 El sistema de expresión libre de células TX-TL se ha demostrado para gran ensamblaje escala del circuito, la exploración de los fenómenos biológicos, y la expresión de proteínas bajo las dos promotores T7 y endógenos. 6,8 modelos matemáticos de acompañamiento están disponibles. 9,10 El sistema resultante tiene aplicaciones únicas en la biología sintética como un entorno de creación de prototipos, o &quot;TX- protoboard biomolecular TL &quot;.

Hemos presentado un protocolo de cinco días para la preparación de una Escherichia coli endógena sistema de expresión libre de células TX-TL basado. Una línea de tiempo de la muestra para la creación de los reactivos - extracto celular en bruto y de amortiguamiento - se puede encontrar en la Figura 1. Una vez creado, éstos se pueden almacenar a -80 ° C durante hasta un año. Una vez creados los reactivos, la configuración experimental y ejecución se puede hacer en menos de 8 horas. Además, hemos optimizado las condiciones de expresión del sistema de expresión libre de células TX-TL. Otras adiciones proporcionadas por el usuario, tales como tampones o soluciones de ADN, deben ser calibrados para la toxicidad de antemano. Por ejemplo, diferentes métodos de procesamiento de los resultados en plásmidos de expresión diferente debido al contenido de sal. También hemos probado el efecto de tampón de elución Tris-Cl en la eficiencia de reacción (Figura 5). Un ejemplo de calibración extracto celular crudo, refiriéndose paso 04.01 a 04.09, se muestraen la Figura 4a. En general, nuestros experimentos muestran que el extracto celular en bruto es más sensible a los niveles de Mg-glutamato, seguido de niveles K-glutamato. Para demostrar el sistema de expresión libre de células, construimos y probamos un circuito de retroalimentación negativa basada en tet represión. 26 (Figura 6). En el sistema de expresión libre de células, el mismo recorrido del circuito con y sin ATC muestra un punto final cambia la expresión de 7 veces de reportero deGFP después de ocho horas de expresión. Aunque este experimento no requiere inductores o represores globales, si es necesario se pueden añadir en &quot;Maestro Preparación de la mezcla.&quot; <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figura 1. Línea de tiempo para el extracto celular en bruto, solución de aminoácidos, y preparación de la solución de energía. Un Timelin de cinco días<html> E para una ejecución típica del protocolo se ha dado anteriormente, optimizado para incubaciones durante la noche y pasos de trabajo durante el día. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figura 2. Costos y análisis de la expresión de competir extractos celulares crudos. a) Desglose de los costos de mano de obra y materiales del sistema de expresión libre de células TX-TL. Sobre la base de los costos de reactivos a partir de diciembre de 2012, y los costos de mano de obra de $ 14 por hora. B) Comparación de la TX-TL costos del sistema de expresión libre de células frente a otros sistemas comerciales. Los costos se dividen por l, aunque los volúmenes de reacción pueden variar según el kit. C) Comparación de la TX-TL libre de células rendimiento sistema de expresión frente a otros sistemas comerciales. Rendimiento de expresión de proteínas determinada por las normas del fabricante./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figura 3. La carga y el procesamiento de un tubo de perlas de latir. a) Demostración de la viscosidad correcta de solución célula-perla. Solución Cell-grano tendrá una viscosidad depende de muchos factores, incluyendo la cantidad de tampón S30A añadido, la cantidad de cuentas de agregados, y el tiempo pasado en el hielo. B) Carga de cordón tubo-batir antes de la centrifugación de mesa rápido. La centrifugación elimina las burbujas acumuladas durante la carga. C) de burbujas a la superficie después de la centrifugación tablero de la mesa. El tamaño de las burbujas puede variar, ya que pueden hacer estallar o eliminar con una punta de pipeta d) de tubo de bolas-superando completamente lleno antes de la limitación.. Se forma un menisco en el cordón de-batiendo tube, y la tapa tiene suficiente para cubrir y causar pequeñas cantidades para llenar en exceso. e) Aparato de filtro cargado correctamente. Estos pueden ser reutilizados. F) Comparación de la correcta vs cordón tubo-superando incorrectamente procesada. El tubo de la izquierda es un tubo bien-beat - que cuenta con un pequeño y bien delineada capa superior, y un sobrenadante claro. El tubo de la derecha es subóptima, en base a la, segunda capa nebuloso más grande y el sobrenadante turbio. Tubos que son subóptimas no deben someterse a un procesamiento adicional. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figura 4. Propiedades de preparaciones de extracto crudo. a) parcelas de calibración típicas para extracto celular en bruto. Extracto crudo se calibra para el Mg-glutamato adicional, K-glutamato, y los niveles de TDT, en ese orden. Se muestra fluorescenc punto finale después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Sobre la base de estas parcelas, un rango aceptable de Mg-glutamato adicional es 4 mM, K-glutamato es 60-80 mM, y DTT es 0-3 mM. Tenga en cuenta que cada extracto en bruto necesita ser calibrado de forma independiente para estas tres variables. B) Variación de preparaciones de extractos. Se muestra de punto final de fluorescencia de dos extractos crudos preparados en fechas diferentes; barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figura 5. Efectos de la solución de ADN en la eficacia de la expresión. a) Comparación de dos purificación diferentemétodos para el procesamiento de plásmidos. 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 se prepara usando solamente un kit de Spin Miniprep Qiaprep (método de purificación 1) o post-procesado con un kit de purificación de PCR QIAquick (método de purificación 2). Se muestra la fluorescencia de punto final después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Las barras de error son de 1 desviación estándar de cuatro carreras independientes en diferentes días. B) Efecto del tampón de elución (Tris-Cl). Diferentes concentraciones de Tris-Cl se comparan en una reacción de expresión libre de células basado en la expresión de 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Las concentraciones dadas son concentraciones finales de Tris-Cl en la reacción; tampón de elución utilizado es 10 mM de Tris-Cl. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <p class="jove_content" fo:páginas together.within-keep = &quot;always&quot;&gt; <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figura 6. Muestra de ejecución TX-TL de un bucle de retroalimentación negativa. a) Ejemplo de configuración de una reacción de ejecución libre de células. Tests &quot;en&quot; contra &quot;de&quot; estado de la curva de retroalimentación negativa, con controles positivos y negativos. B) El plásmido mapa de bucle de retroalimentación negativa. C) Los resultados representativos. Los datos reflejan experimento en a) y b), con el control negativo se resta de la señal. Circuito genético muestra en la inserción. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> El cloranfenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml en etanol </td><td> 1 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) </td><td> Puede ser hecho en volúmenes más grandes almacenados a -20 ° C para su uso posterior. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + placa de agar Cm </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico, 34 mg / ml de cloranfenicol </td><td> 1 placa </td><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P multimedia </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico </td><td> 4 L </td><td> Autoclave </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos para el día 1 del protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </strong&gt; </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) o en autoclave </td><td> Se puede almacenar a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) </td><td> Puede ser hecho en volúmenes más grandes y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior. </td></tr><tr><td> Búfer S30A </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, mM de Tris, pH 7,7 50 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para llegar a pH 7,7, valorar con ácido acético. Añadir TDT a 2 mM de concentración final, justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Búfer S30B </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, ~ 5 mM de Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para llegar a pH 8,2, se valora con 2 MTris. Añadir TDT a 1 mM concentración final justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos para el día 2 del protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Halcón </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vacío 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon con pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masa de pellets (50 ml Falcon con pellet - vacío 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volumen de tampón S30A añadir (masa de pellets * 0.9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masa total de cuentas para agregar (masa de pellets * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Búfer S30A y calculadora de masa del grano, para el día 3 de protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 8, titule con KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM de ATP y GTP, CTP y UTP mM, de pH 7,5 94 </td><td> 1,5 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 7,5, titule con KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 l </td><td> Ninguno </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 l </td><td> Ninguno </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 l </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a pH 7,5-8, titule con Tris 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 l </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 8, titule con Tris 2 M. </td></tr><tr><td> El ácido folínico </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 l </td><td> Ninguno </td><td> Aunque se necesitan sólo 300 l, receta en suplementario es de 1,15 ml. </td></tr><tr><td> La espermidina </td><td> 1 M </td><td> 150 l </td><td> Ninguno </td><td> Almacenar a 4 ° C, el calor a 37 ° C para fundir. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 7,5, se valora con Tris 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Reactivos para prepararse para el protocolo Energy Solution. Material complementario 1. Recetas para los artículos. El cloranfenicol, 34 mg / ml: Preparar 0,51 g de cloranfenicol y añadir etanol a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior. 2xYT + P + placa de agar Cm: Preparar 1,24 g 2xYT, 1,6 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, 0,88 ml de solución de fosfato monobásico de potasio @ 1 M, 0,6 g de agar, y el agua a 40 ml. Autoclave. Dejar enfriar a 50 ° C y añadir 40 l Cm. Alícuota de 25 ml en una placa de 100 x 15 mm Petri, y deje que se enfríe durante una hora. 2xYT + P los medios de comunicación: Preparar 124 g 2xYT, 160 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, solución de 88 ml de fosfato de potasio monobásico @ 1 M, y agua a 4 L. Aliquot hacia 2 x 1,88 L y 0,24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60,57 g Tris base y agua hasta 250 ml. Esterilizar, almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. TDT, 1 M: Preparar 2,31 g TDT y el agua a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior. Búfer S30A: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, 50 ml de Tris a 2 M, ácido acético (pH 7,7), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 4 ml 1 M DTT antes de su uso. Búfer S30B: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, Tris 2 M (pH 8,2), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 2 ml de 1 M DTT antes de su uso. HEPES: Preparar 1,91 g de HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), y agua a 4 ml. ARNt: Prepare 30 mg de ARNt y agua a 600 l. CoA: Preparar 30 mg de CoA (MW 767,53) y agua a 600 l. NAD: Añadir 34,83 ​​mg de NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), y agua a 300 l. (Añadir 27 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5-8). cAMP: Agregar 42,80 mg de cAMP (PM 329,22), Tris 2 M (pH 8), y el agua a 200 l. (Añadir 73 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 8). Ácido folínico (33,9 mM): Para 20 mg de sal de calcio de ácido folínico sólido (MW 511.5), añadir 1,15 ml de agua. La espermidina: Preparar 23,55 l de espermidina (MW 145,25) y agua a 150 l. Preparar a temperatura ambiente después de la fusión brevemente a 37 ° C. 3-PGA: Añadir 1,03 g de 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (a pH 7,5), y agua a 3,2 ml. (Añadir 1,73 ml de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5). Nucleotide Mix: Añadir 145 mg de ATP dipotásico dihidrato de sal (MW 619.4), 133 mg de sal disódica GTP (MW 567,14), 79,4 mg de sal disódica dihidrato CTP (MW 563,16), 82,6 mg de dihidrato de la sal trisódica UTP (MW 586,12) , KOH a 15% de dilución (a pH 7,5), y agua a 1,5 ml. (Añadir 353 l de KOH a 15% de dilución para llevar la solución a pH 7,5). Material suplementario 2. Ensayo de Bradford. <ol><li> Eliminar los agentes Bradford de 4 ° C y se pondrá a la temperatura ambiente. </li><li> Preparar 50 l de BSA estándar a 1 mg / ml y a 0,1 mg / ml. </li><li> Preparar 40 l de 20x de dilución del extracto de la etapa 1.47. </li><li> Añadir 800 l de agua a 7 cubetas. </li><li> Preparar cubetas estándar para 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 l 0,1 mg / ml de BSA), 2 mg / ml (20 l 0,1 mg / ml de BSA), 4 mg / ml (4 l 1 mg / ml de BSA) , 6 mg / ml (6 l 1 mg / ml de BSA). </li><li> Preparar cubetas experimentales para 2 l de muestra y 4 l de muestra. </li><li> Añadir 200 l de agente de Bradford a cada cubeta y mezclar bien bY pipeteado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min. </li><li> Producir curva estándar a una DO de 595 nm usando cubetas de paso 6.5. Rechazar curva estándar si r 2 &lt;0,95. </li><li> Determinar la concentración del extracto a una DO de 595 nm utilizando cubetas desde el paso 6.6. </li></ol> Material complementario 3. Tampón de hoja de cálculo de calibración. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Ver TXTL_e (plantilla) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Material suplementario 4. Expresión libre de células ejecutar hojas de cálculo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Ver TXTL _JoVE.xlsx</a> .

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Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un<em&gt; Escherichia coli</emSistema&gt; Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

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