Name: protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Vi tackar Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, och Enoch Yeung om hjälp att effektivisera protokollet, och Clare Chen och Barclay Lee för att få hjälp i ett tidigt skede av projektet. Detta material är baserat på arbete stöds delvis av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Gjuterier program, kontraktsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS stöds också av en UCLA / Caltech Medical Scientist träningsprogram gemenskap och genom en DoD, flygvapnet Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De åsikter och slutsatser i detta dokument är författarnas egna och ska inte tolkas som officiellt politik, varken uttryckligen eller underförstått, för Defense Advanced Research Projects Agency och den amerikanska regeringen.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Den endogena Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem som beskrivs här är en enkel att köra tre rör reaktion som kan ta mindre än åtta timmar från inrättats för att datainsamling. Processen att skapa alla reagenser kräver fem dagars tid totalt (med stora behov av arbetskraft på bara en dag), men producerar råextrakt för 3.000 reaktioner och buffert-göra reagenser för 10.000 reaktioner (Figur 1). Dessutom råextrakt och buffert-göra reagenser är stabila i minst 1 år vid -80 ° C, vilket möjliggör flera användningsområden för ett preparat. 4 På $ 0,11 per 10 pl reaktion ($ 0,26 inklusive arbetskraft), kostnaderna är 98% lägre än jämförbara kommersiella system (figur 2). Det finns några olösta begränsningar emellertid till systemet. Slut effektivitet varje råcellextrakt preparatet kan variera beroende på användarens kompetens och miljöförhållanden, även om typical avkastning variationen är mellan 5-10% (figur 4b). Som ett resultat, batch-till-batch variation i både slutpunkten uttryck och uttrycksdynamik är att vänta. Dessa variationer kommer sannolikt att förbli tills extraktet helt karaktäriseras eller tills extrakt skapelsen är helt automatiserad. Om cellfria expressionssystem används för att utföra känsliga kvantitativa experiment, är det lämpligt att köra alla experiment med samma parti av råcellextrakt. Utbytet från en enda råcellextrakt sats, cirka 3000 reaktioner bör vara tillräckliga för typiska experimentella kurser. Även om vi misstänker att variationen kan tas bort genom att skala upp och automatisera förfarandet, skulle sådana försök innebär en betydande investering resurs. Dessutom, även om slutpunkten uttrycksnivåer är relativt lätt att avgöra, behöver mer arbete att göra för att förstå dynamiken inneboende till cellfritt system. Det är känt att både resurs KONKURRENSn och resursbegränsning kan påverka uttrycks dynamik. Exempelvis kan begränsad endogen sigma 70 resultera i en mätt regim med ökad DNA-mall som producerar en expressionsprofil analogt med det i nukleotid-eller aminosyra utarmning. 9,27 dock dynamiken har inte till fullo förstås att utnyttja systemet. För rena ökningar av avkastningen, kan optimering göras av maskinlärandestrategier. 28 Frågor om resurskonkurrens och begränsning kan åtgärdas genom matematiska modeller verifieras med hjälp av experimentella data. Protokollet presenteras här är optimerad för en BL21-Rosetta2 stam, men är generaliserbara till andra E. coli-stammar. Modifieringar i BL21-Rosetta2, såsom avlägsnande av den gen som kodar lon proteas och tillsättning av gener som kodar sällsynta tRNA, möjliggöra maximal proteinproduktion. Vi har försökt protokollet med två andra stammar extrakt - bara BL21 och BL21 TrxA knockout-end fann 50% lägre proteinavkastning. Vår hypotes är att avkastningen på motsvarande sätt minskar vid användning av andra stammar. Övriga förändringar av parametrar, som till exempel att byta 2xYT tillväxtmedium för LB och andra rika buljonger, har resulterat i minskad proteinavkastning. Cellfria expressionssystem utnyttjar både endogena och exogena transkription-translation maskiner och regleringsmekanismer har breda tillämpningar inom både protein och metabolit uttryck och i syntetisk biologi. 3,29 Istället för att vara begränsad till T7-reglerade kretsar, kan man föreställa sig att producera komplexa biomolekyler på ett användar kontrollerbar miljö med hjälp av en blandning av infödda E. coli-promotorer och exogent medföljande transkription och reglermekanismer. Utan begränsningar av celldelning och metabolism, kan variationen i syntetiska kretsar såsom repressilator eller metaboliska konstruerad vägar som de som producerar artemisinin minskas eller bättre förstås. 30,31 Vi HAVe använt dessa fördelar för att genomföra genetiska switchar, samt att förstå sigmafaktor kvarstad 9,32 Sådan teknik kan också utgöra ryggraden i &quot;minimal&quot; eller &quot;artificiella&quot; celler -. liten, väl karakteriserad och självförsörjande förkroppsligad enheter extrakt. 33,34 I slutändan, vi räknar med omedelbar användning av denna endogena cellfria expressionssystem som ett prototypmiljö för syntetisk biologi. Och kallas &quot;TX-TL biomolecular breadboard&quot;, det cellfria expressionssystem tillhandahåller en styrbar miljö där syntetiska kretsar slutligen avsett för in vivo-uttryck kan genomgå rundor av prototyper - cykler av testning på grundläggande plasmid, linjär, eller kemiskt syntetiserade DNA: t, följt genom analys och snabb förändring. Prototyp rundor kan vara hjälpt av prediktiva matematiska modeller håller på att utvecklas. Genom att ta bort kloning och in vivo manipulation för icke-slutkretsar, räknar vi ingenjörerneering cykeltiderna reduceras till 1-3 dagar i stället för de aktuella veckors standard.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Cell-yttrandefrihet tekniken började på 1950-talet som rent translationell, avancera år senare att omfatta kopplade mekanismer transkription-översättning med hjälp av T7 bakteriofag-DNA. 11,12 Sedan dess har många försök gjorts för att optimera skapandet av råcellextrakt (eller E . coli S30-extrakt). 13,14 Dessa optimeringar inkluderar förlänga cellfria proteinsyntes genom ATP-regenerering eller stam modifieringar, och minska protokoll tid och kostnad. existerar 15-17 Alternativa cellfria expressionssystem som använder rekonstituerade komponenter i stället för råolja cellextrakt för uttryck. 5 Både råcellextrakt och beredning metoder har utvecklats för kommersiellt bruk. Med tillkomsten av syntetisk biologi, finns det ett ökat behov av en väldefinierad plattform för att testa och uttrycka manipulerade biologiska moduler och kretsar. 18,19 Denna plattform ska varamångsidig, väldefinierad, enkla att manipulera, och fokuserat på användar inköpta komponenter. Trots att utvecklas ett halvt sekel tidigare cellfria system baserade på E. coli dela sig är dessa krav, eftersom de är en förenklad in vitro-representation av cellulära processer utan komplexiteten av tillväxt och metabolism. Dessutom har alla de grundläggande kunskaper från in vivo arbete på E. coli gäller lätt till E. coli cellfria system. Trots att cellfria expressionssystem kan ha tillämpningar inom syntetisk biologi, hittills målet för de flesta cellfria expressionssystem har varit att maximera protein och metabolit avkastning. Detta åstadkommes genom användning av T7-bakteriofag-transkription av sekvenser som drivs av T7-promotorer. 20 Även om uttrycket är effektiv och robust, dessa system tjänar en högspecialiserad syfte. Cellregleringsmetoder är begränsade, måste mål-DNA-mallar varaomarbetade för att inkludera T7-promotorer, och vissa sekvenser såsom ribosomala komplex inte kan transkriberas och monteras. 21,22 Befintliga cellfria expressionssystem inte kan upprätthålla hög avkastning samtidigt som endogena reglerande mekanismer, en mångsidighet som behövs för syntetisk biologi. Vi har utvecklat en endogen E. coli cellfria expressionssystem som bevarar effektiviteten i proteinuttryck framgår av tidigare system, men lägger till ytterligare mångsidighet genom att tillåta uttryck och reglering baserad på både endogena och exogena (T7 eller andra) mekanismer. Protokollet som beskrivs här är ursprungligen baserad på Kigawa et al. (2004) och Liu et al. (2005), men har betydande förändringar. Den använder Mg-och K-glutamat över Mg-och K-acetat för ökad effektivitet, avlägsnar 2-merkaptoetanol, och lyserar cellerna genom att använda en Bead-Beater. 17,23,24 Bead-stryk väljs framför homogenisering,tryckbaserade metoder eller ultraljudsbehandling på grund av dess lägre kostnad och med jämförbara utbyten till konkurrerande system. 23 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) används som energikälla, eftersom man fann att ge överlägsna proteinutbyten jämfört med kreatinfosfat och fosfoenolpyruvat. 4,25 Vårt system kan producera upp till 0,75 mg / ml reporter protein med hjälp av antingen en sigma70 baserad promotor med lambda-fag operatörer eller en T7-driven promotor, liknande avkastning från andra kommersiella system. 4,6 Fem dagar krävs för att producera alla nödvändiga reagenser (Figur 1). Dessutom ger det en minskning 98% kostnad än andra kommersiella cellfria system - materialkostnader är $ 0,11 per 10 pl reaktion, som stiger till 0,26 $ med arbetskraft ingår (Figur 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Idealiska cellfria expressionssystem kan teoretiskt emulera en in vivo cellmiljö i en kontrollerad in vitro-plattform. 1 Detta är användbart för att uttrycka proteiner och genetiska kretsar på ett kontrollerat sätt samt för att ge en prototypmiljö för syntetisk biologi. 2,3 För att uppnå det senare målet, cellfria expressionssystem som bevarar endogen Escherichia coli mekanismer transkription-översättning kan bättre återspeglar cellulära dynamik in vivo än de som baseras på T7 RNA-polymeras transkription. Vi beskriver förberedelserna och genomförandet av ett effektivt endogen E. coli baserade transkription-translation (TX-TL) cellfria expressionssystem som kan ge likvärdiga mängder protein som T7-baserade system med en 98% kostnadsminskning till liknande kommersiella system. 4,5 Beredningen av buffertar och råcellextrakt är beskrivs, liksom utförandet av entre rör TX-TL reaktion. Hela protokollet tar fem dagar att förbereda och ger tillräckligt med material för upp till 3000 enkla reaktioner i en beredning. Efter beredning, tar varje reaktion under 8 timmar från installation till datainsamling och analys. Mekanismer för reglering och transkriptions exogena till E. coli, såsom lac / Tet-repressorer och T7 RNA-polymeras, kan kompletteras. sex Endogena egenskaper, såsom mRNA och DNA nedbrytningshastigheter kan också justeras. 7 TX-TL cellfritt expressionssystem har visats för stor- skala kretskort, utforska biologiska fenomen och uttryck av proteiner under både T7-och endogena promotorer. 6,8 Kompletterande matematiska modeller finns tillgängliga. 9,10 Det resulterande systemet har unika tillämpningar inom syntetisk biologi som en prototypmiljö, eller &quot;TX- TL biomolekylära bakbord. &quot;

Vi har presenterat en fem dagars protokoll för beredning av en endogen Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem. Ett prov tidslinje för att skapa de reagens - råcellextrakt och buffert - kan hittas i figur 1. En gång skapats kan dessa förvaras vid -80 ° C i upp till ett år. Efter reagenser skapas, kan experimentuppställning och utförande göras på mindre än 8 timmar. Dessutom har vi optimerat expressionsförhållanden TX-TL cellfria expressionssystem. Andra användarmatade tillsatser, såsom buffertar eller DNA-lösningar, bör kalibreras med avseende på toxicitet i förväg. Till exempel, olika metoder för bearbetning plasmider resulterar i olika uttryck beroende på salthalt. Vi testade även effekten av Tris-Cl elueringsbuffert på reaktionseffektiviteten (Figur 5). Ett exempel på råcellextrakt kalibrering, hänvisa steg från 4,1 till 4,9, visasi figur 4a. I allmänhet våra experiment visar att det råa cellextraktet är mest känsligt för Mg-glutamatnivåer, följt av K-glutamatnivåer. För att demonstrera den cellfria expressionssystem, vi konstruerat och testat en negativ återkopplingsloop baserad på tet-repression. 26 (figur 6). I det cellfria expressionssystem, samma krets körning med och utan ATC visar en 7-faldig ändpunktsexpressionsändring deGFP reporter efter åtta timmar av uttryck. Trots att detta experiment inte kräver globala inducerare eller repressorer, om nödvändigt kan de läggas till under &quot;Master Mix Förberedelse.&quot; <img alt="Figur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figur 1. Tidslinje för råcellextrakt, aminosyralösning, och förberedelse energilösning. En femdagars timelin<html> e för ett typiskt utförande av protokollet ges ovan, optimerad för övernattning inkubationer och dagtid arbetssteg. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figur 2. Kostnad och uttrycksanalys av konkurrerande extrakt rå cell. a) Fördelning av kostnaderna för arbetskraft och material för TX-TL cellfria expressionssystem. Baserat på kostnader för reagens och med december 2012 och arbetskostnader för $ 14 per timme. B) Jämförelse av TX-TL kostnader cellfria expressionssystem jämfört med andra kommersiella system. Kostnaderna fördelar sig per il, även om reaktionsvolymen kan variera per sats. C) Jämförelse av TX-TL cellfria expressionssystem avkastning kontra andra kommersiella system. Proteinuttryck avkastning bestäms av tillverkarens standarder./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figur 3. Lastning och bearbetning av en pärla-stryk röret. a) Demonstration av rätt viskositet för cell-pärla lösning. Cell-pärla lösning kommer att ha en viskositet beroende av många faktorer, bland annat mängden S30A buffert till, mängden pärlor tillsatta, och tid på isen. B) Påfyllning av pärla-slå röret innan snabb bordscentrifugering. Den centrifuge bort bubblor ackumulerats under lastning. C) Bubbles beläggningsarbeten efter bordscentrifugering. Storleken av bubblorna kommer att variera, och de kan dök eller avlägsnas med användning av en pipettspets d) helt fylld vulst ledande röret före begränsning.. En menisk bildas i pärlan-stryk tUbe, och locket har tillräckligt för att täcka och orsakar små mängder för att överfylla. e) Rätt laddade filterapparat. Dessa kan återanvändas. F) Jämförelse av rätt kontra fel bearbetat pärla ledande rör. Röret till vänster är en väl-beat tube - det finns en liten och väl avgränsad översta lagret, och mycket klar supernatant. Röret till höger är suboptimal, baserat på den större, disigt andra skiktet och den dimmiga supernatanten. Rör som är suboptimal bör inte genomgå ytterligare bearbetning. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figur 4. Egenskaperna hos preparat råextrakt. a) Typiska kalibrerings tomter för råcellextrakt. Råextrakt är kalibrerat för ytterligare Mg-glutamat, K-glutamat, och DTT-nivåer, i den ordningen. Visas är endpoint fluorescence efter 8 timmar, samt maximal hastighet av proteinproduktion baserad på en 12-minuters glidande medelvärde. Baserat på dessa ytor, är ett godtagbart intervall av ytterligare Mg-glutamat 4 mM, K-glutamat är 60-80 mM och DTT är 0-3 mM. Observera att varje råextrakt måste kalibreras individuellt för dessa tre variabler. B) Variation från förberedelser extrakt. Endpoint fluorescens av två råextrakt som framställts på olika datum visas, felstaplar är 1 standardavvikelse från tre oberoende körningar på olika dagar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figur 5. Effekter av DNA-lösningen på expressionseffektivitet. a) Jämförelse av två olika reningsmetoder för behandling av plasmider. 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 är beredd att använda endast en QIAprep Spin Miniprep Kit (Rening metod 1) och efterbehandlade med en QIAquick PCR-reningssats (Rening metod 2). Visas är endpoint fluorescens efter 8 timmar, samt maximal hastighet av proteinproduktion baserad på en 12 minuters glidande medelvärde. Felstaplar är en standardavvikelse från fyra oberoende körningar på olika dagar. B) Effekt av elueringsbuffert (Tris-Cl). Olika koncentrationer av Tris-Cl jämförs i ett cellfritt uttryck reaktion baserad på uttrycket av 1 nM av pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Koncentrationer anges är slutliga koncentrationer av Tris-Cl i reaktionen; elueringsbufferten som används är 10 mM Tris-Cl. Felstaplar är 1 standardavvikelse från tre oberoende körningar på olika dagar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;alltid&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figur 6. Prov TX-TL körning av en negativ återkopplingsslinga. a) Provformatet i ett cellfritt utförande reaktionen. Tester &quot;på&quot; kontra &quot;off&quot; läget i negativ återkoppling, med positiva och negativa kontroller. B) Plasmid karta över negativ återkoppling. C) Representativa resultat. Data visar experiment i a) och b), med negativ kontroll subtraheras från signalen. Genetisk krets som visas i insatsen. Felstaplar är 1 standardavvikelse från tre oberoende körningar på olika dagar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Koncentration </td><td> Mängd </td><td> Sterilisering </td><td> Anmärkningar </td></tr><tr><td> Kloramfenikol (Cm) </td><td> 34 mg / ml i etanol </td><td> 1 ml </td><td> Filtrera sterilisera (0,22 | iM) </td><td> Kan tillverkas i större volymer lagras vid -20 ° C för senare användning. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm agarplatta </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM kaliumfosfat, dibasiskt, 22 mM kaliumfosfat, monobasiskt, 34 pg / ml kloramfenikol </td><td> En platta </td><td> Autoklav </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P media </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM kaliumfosfat dibasiskt, 22 mM kaliumfosfat monobasiskt </td><td> 4 L </td><td> Autoklav </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Reagens för dag 1 av råcellextrakt protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Koncentration </strong&gt; </td><td> Mängd </td><td> Sterilisering </td><td> Anmärkningar </td></tr><tr><td> Tris-bas </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filter sterilisera (0,22 M) eller autoklav </td><td> Kan förvaras vid rumstemperatur. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> En M </td><td> 6 ml </td><td> Filtrera sterilisera (0,22 | iM) </td><td> Kan tillverkas i större volymer och lagrades vid -20 ° C för senare användning. </td></tr><tr><td> S30A buffert </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> För att nå pH 7,7, titrera med ättiksyra. Lägg DTT till 2 mM slutlig koncentration just före användning. Förvaras vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> S30B buffert </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoklav </td><td> För att nå pH 8,2, titrera med 2MTris. Lägg DTT till 1 mM slutlig koncentration just före användning. Förvaras vid 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Reagens för dag 2 av råcellextrakt protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falcon </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tomma 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon med pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellets massa (50 ml Falcon med pellets - tom 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A buffertvolym för att lägga till (pelletsmassa * 0,9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Totala massan av pärlor att lägga till (pelletsmassa * 5,0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. S30A buffert och pärla mass kalkylator, för dag 3 av råcellextrakt protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Koncentration </td><td> Mängd </td><td> Sterilisering </td><td> Anmärkningar </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Inget </td><td> För att nå pH 8, titrera med KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP och GTP, 94 mM CTP och UTP, pH 7,5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Inget </td><td> För att nå pH 7,5, titrera med KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 | il </td><td> Inget </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 | il </td><td> Inget </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 | il </td><td> Inget </td><td> För att nå pH 7.5-8, titrera med Tris vid 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 | il </td><td> Inget </td><td> För att nå pH 8, titrera med Tris vid 2 M. </td></tr><tr><td> Folinsyra </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 | il </td><td> Inget </td><td> Även om det krävs bara 300 l, är recept på extra för 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> En M </td><td> 150 | il </td><td> Inget </td><td> Lagra vid 4 ° C, upphetta till 37 ° C för att smälta. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Inget </td><td> För att nå pH 7,5, titrera med Tris vid 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Reagenser för att förbereda sig för Energy Solution-protokollet. Supple Material 1. Recept för objekt. Kloramfenikol, 34 mg / ml: Förbered 0,51 g kloramfenikol och lägga etanol till 15 ml. Filtrera sterilisera (0,22 M), alikvot till 1 ml rör, förvara vid -20 ° C för senare användning. 2xYT + P + Cm agarplatta: Förbered 1,24 g 2xYT, 1,6 ml kaliumfosfat dibasisk lösning @ 1 M, 0,88 ml kaliumfosfat monobasiskt lösning @ 1 M, 0,6 g agar, och vatten till 40 ml. Autoklav. Låt svalna till 50 ° C och tillsätt 40 l Cm. Fördela 25 ml i en 100 x 15 mm petriskål, och låt svalna i en timme. 2xYT + P medier: Förbered 124 g 2xYT, 160 ml kaliumfosfat dibasisk lösning @ 1 M, 88 ml kaliumfosfat monobasiskt lösning @ 1 M, och vatten till 4 L. Aliquot ut i 2 x 1,88 L och 0,24 L autoklav. Tris-bas, 2 M: Förbered 60.57 g Tris bas och vatten till 250 ml. Sterilisera, lagra vid RT för senare användning. DTT, 1 M: Förbered 2,31 g DTT och vatten till 15 ml. Filtrera sterilisera (0,22 M), alikvot till 1 ml rör, förvara vid -20 ° C för senare användning. S30A buffert: Förbered 10,88 g Mg-glutamat och 24.39 g K-glutamat, 50 ml Tris vid 2M, ättiksyra (till pH 7,7), och vatten till 2 L. Autoklav, förvara vid 4 ° C, tillsätt 4 ml 1 M DTT före användning. S30B buffert: Förbered 10,88 g Mg-glutamat och 24.39 g K-glutamat, Tris vid 2 Mkr (till pH 8,2), och vatten till 2 L. Autoklav, förvara vid 4 ° C, tillsätt 2 ml 1 M DTT före användning. HEPES: Förbered 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (till pH 8) och vatten till 4 ml. tRNA: Förbered 30 mg tRNA och vatten till 600 pl. CoA: Bered 30 mg av CoA (molvikt 767,53) och vatten till 600 | il. NAD: Lägg 34.83 mg NAD (MW 663,43), Tris vid 2 Mkr (till pH 7.5-8), och vatten till 300 ^. (Lägg till 27 l av Tris vid 2 miljoner för att ge lösningen till pH 7.5-8). cAMP: Lägg 42,80 mg av cAMP (MW 329,22), Tris vid 2 Mkr (till pH 8), och vatten till 200 ^. (Lägg till 73 l av Tris vid 2 miljoner för att ge lösningen till pH 8). Folinsyra (33,9 mM): Till 20 mg fast folinsyra kalciumsalt (MW 511,5), tillsätt 1,15 ml vatten. Spermidin: Förbered 23.55 pl spermidin (MW 145,25) och vatten till 150 pl. Bered vid rumstemperatur efter smältning kort vid 37 ° C. 3-PGA: Lägg till 1,03 g av 3-PGA (MW 230,02), Tris vid 2 M (till pH 7,5) och vatten till 3,2 ml. (Lägg till 1,73 ml Tris vid 2 miljoner för att ge lösningen till pH 7,5). Nucleotide Mix: Lägg till 145 mg ATP dikaliumsalt dihydrat (MW 619,4), 133 mg av GTP dinatriumsalt (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumsaltdihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumsalt dihydrat (MW 586,12) , KOH vid 15% spädning (till pH 7,5) och vatten till 1,5 ml. (Lägg till 353 l av KOH 15% spädning för att lösningen till pH 7,5). Kompletterande materialet 2. Bradford-analys. <ol><li> Ta Bradford agent från 4 ° C och ställ i rumstemperatur. </li><li> Förbered 50 pl BSA standard vid 1 mg / ml och vid 0,1 mg / ml. </li><li> Förbered 40 l 20x utspädning av extrakt från steg 1,47. </li><li> Addera 800 pl vatten till 7 kuvetter. </li><li> Bered standard kyvetter för 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 | il 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 | il 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ^ il 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 pl 1 mg / ml BSA). </li><li> Förbered experimentella kyvetter för 2 l av prov och 4 l av prov. </li><li> Addera 200 pl av Bradford agent till varje kuvett och blanda väl by pipettering. Inkubera vid rumstemperatur under åtminstone 10 min. </li><li> Producera standardkurva vid OD 595 nm med hjälp av kyvetter från steg 6,5. Avvisa standardkurva om r 2 &lt;0,95. </li><li> Bestäm extrakt koncentration vid OD 595 nm med hjälp av kyvetter från steg 6.6. </li></ol> Kompletterande materialet 3. Buffert kalibrerings kalkylblad. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Se TXTL_e (mall) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Kompletterande materialet 4. Cell-yttrandefrihet köra kalkylblad. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Se TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Denna femdagars-protokollet beskriver alla steg, utrustning och extra programvara som krävs för att skapa och driva en effektiv endogen Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem från grunden. Med reagenser, tar det protokoll 8 timmar eller mindre att installera en reaktion, samla in och bearbeta data.

Protokoll för Implementera en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baserad TX-TL Cell-Free Expression System för syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Test för att mäta aktiviteten hos Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenes och Funktionell Val Protokoll för riktad evolution av proteiner i E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Snabb Protokoll för Beredning av elektro<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Och<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Upptäckt av Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler genom PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mångfacetterade Fördelar med Protein Samexpression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Baserat Cell yttrandefriheten System för uttryck av<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Återstod specifika Införande av Noncanonical aminosyror i modellproteiner Använda en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cellfritt Transkription-översättning System